胆囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表达及与临床病理特征和预后的关系

徐顺林，格桑志玛，土登·降拥尼玛，贾礼华

胆囊癌是目前临床较为罕见的一种高致死性恶性肿瘤性疾病[1]。2018年，根据国际癌症研究机构数据库数据分析显示，胆囊癌占所有癌症相关死亡的1.7%[2]。根据报道，在世界范围内，胆囊癌对女性的影响较男性大，此外胆囊癌的发生率随着人们年龄的增长而逐渐升高，有2/3的胆囊癌患者年龄超过了65岁[3]。根据美国癌症协会称，仅有约1/5的胆囊癌患者在肿瘤未转移前被发现，这极大限制了治疗方法的选择，并且显著缩短了患者的生存时间[4]。化学疗法和放射疗法对胆囊癌的作用不大，根治性手术仍然是目前本病最为有效的治疗方法。但是因为胆囊癌患者初期常常无症状及其快速转移的特点，使得大多数胆囊癌患者诊断时已处于晚期，只有不到20%的患者符合手术切除条件，导致该病预后大多不良[5]。因此，发现新的潜在生物学标志物用于预后评估和深入阐明癌症进展的分子机制，对于更好地治疗胆囊癌具有一定的价值。MicroRNA(miRNA)是非编码、进化保守的单链RNA，它们附着在其靶基因的3'-非翻译区(3'-UTR)的互补结合位点上，并且通过转录后基因调控发挥着各种生物学功能[6]。最近许多miRNA已证明可作为癌症有效的生物学标志物或功能性调节剂[7]。故本研究拟通过对胆囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143水平进行分析，探讨其与胆囊癌患者临床病理特征和预后的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年1月—2017年6月就诊的胆囊癌患者86例作为疾病组，同期体检健康志愿者40例作为对照组。疾病组中男33例，女53例；年龄52～75(64.28±5.47)岁；分化程度：低分化39例，中分化25例，高分化22例；TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期20例，Ⅲ期36例，Ⅳ期17例；淋巴结转移29例。对照组中男14例，女26例；年龄50～75(62.15±4.85)岁。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：依据第八版《外科学》[8]中相关诊断标准初诊为胆囊癌；经术后病理学检查确诊；签署本研究知情同意书；采用胆囊切除加区域淋巴结清扫术，且未接受术后辅助治疗；具有完整的临床资料；能积极配合随访。排除标准：已接受化疗者；伴其他肿瘤者；伴心、肺、肝、肾功能不全者；失访者。

1.3检测方法 治疗前，抽取2组日晨空腹静脉血5 ml，3000 r/min离心10 min后收集血清，使用总RNA提取试剂盒(德国QIAGEN，miRNeasy Serum Kit)提取血清总RNA，使用miRNA反转录试剂盒(HaiGene，TaqMan miRNA Cdna Kit)反转录获得cDNA，使用荧光定量聚合酶链式反应采用2-ΔΔCt法以U6作为内参基因检测miRNA-187和miRNA-143表达量。操作按试剂盒说明书进行。各引物序列见表1。

表1 荧光定量聚合酶链式反应相关引物序列

1.4随访方法 采用门诊或电话随访，随访时间截止至2020年6月或患者死亡。每2个月随访1次，记录2组生存时间，并计算3年生存率。生存时间为确诊日期到死亡日或2020年6月。

2 结果

2.12组血清miRNA-187和miRNA-143表达比较 荧光定量聚合酶链式反应结果表明，相较对照组，疾病组miRNA-187表达高，miRNA-143表达低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 胆囊癌患者和体检健康志愿者血清miRNA-187和miRNA-143表达比较

2.2胆囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表达与临床病理特征的关系 胆囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表达与患者性别、年龄、淋巴结转移无关(P>0.05)，与分化程度、TNM分级有关(P<0.01)。见表3。

表3 胆囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表达与临床病理特征的关系

2.3血清miRNA-187和miRNA-143评估胆囊癌的受试者工作特征(ROC)曲线分析 ROC曲线分析显示，血清miRNA-187诊断胆囊癌的截断值为3.294，曲线下面积(AUC)为0.775；miRNA-143诊断胆囊癌截断值为0.375，AUC为0.789。见图1。

图1 血清miRNA-187和miRNA-143评估胆囊癌的受试者工作特征曲线

2.4胆囊癌患者血清miRNA-187和miRNA-143表达与3年生存率分析 根据ROC曲线分析的miRNA-187和miRNA-143截断值将疾病组分为miRNA-187高表达亚组47例、低表达亚组39例和miRNA-143高表达亚组38例、低表达亚组48例。Kaplan-Meire生存曲线分析显示：miRNA-187高表达亚组3年生存率为19.15%低于低表达亚组的51.28%，miRNA-143高表达亚组3年生存率为55.26%高于低表达亚组的16.67%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、图3。

图2 不同血清miRNA-187表达胆囊癌患者生存曲线

图3 不同血清miRNA-143表达胆囊癌患者生存曲线

2.5影响胆囊癌患者3年生存率的单因素分析 单因素分析结果表明，胆囊癌患者性别、年龄、分化程度与3年生存率无关(P>0.05)，TNM分级、淋巴结转移与3年生存率有关(P<0.05)。见表4。

表4 影响胆囊癌患者3年生存率的单因素分析[例(%)]

2.6影响胆囊癌患者3年生存率的Logistic多因素回归分析 以胆囊癌患者3年生存率为因变量(死亡=1、存活=0)，以上述具有统计学意义的单因素为自变量进行赋值(TNM分级Ⅲ～Ⅳ级=1、Ⅰ～Ⅱ级=0，有淋巴结转移=1、无=0，miRNA-187高表达=1、低表达=0，miRNA-143低表达=1、高表达=0)。Logistic多因素回归分析结果显示，TNM分级Ⅲ～Ⅳ级、淋巴结转移、miRNA-187高表达、miRNA-143低表达是胆囊癌患者3年生存率的独立危险因素(P<0.05或P<0.01)。见表5。

表5 影响胆囊癌患者3年生存率的Logistic多因素回归分析

3 讨论

目前尚不清楚胆囊癌的具体致病机制，但有研究已发现女性、地理位置、种族、先天性发育异常、肥胖、胆结石个人或家族史、胆囊慢性感染及遗传变异与胆囊癌发生率升高相关[9]。因胆囊癌患者预后较差，分析胆囊癌发病影响因素，找出早期预测指标，对本病早期干预、改善预后有重要意义。

既往研究表明，miRNA-187在多种癌症中发挥着重要作用，然而作用结果却不大一致。miRNA-187在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达上调，miRNA-187过表达可促进癌细胞的增殖、转移和侵袭[10]。洪善超等[11]也报道前列腺癌患者血清miRNA-187水平升高，并在抑制表达后能降低前列腺癌细胞系增殖能力。另有研究表明，miRNA-187在人宫颈癌细胞中表达下调，其通过抑制宫颈癌细胞增殖和促进细胞凋亡发挥抑癌作用，体内实验也证明miRNA-187能抑制小鼠宫颈癌细胞的生长[12]。Wang等[13]证明miRNA-187在结肠癌组织和细胞系中表达显著下调，通过Kaplan-Meire生存曲线分析发现miRNA-187表达降低与结肠癌患者总生存期较短密切相关，提示miRNA-187可显著抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭，并促进细胞凋亡。这些研究表明miRNA-187的表达具有异质性。在本研究中，胆囊癌患者血清miRNA-187表达上调，与李刚强和濮亚斌[14]研究结果一致；同时，胆囊癌患者血清miRNA-187表达与其分化程度、TNM分级有关，且miRNA-187高表达患者3年生存率更低，表明miRNA-187可能起到促癌作用。

miRNA-143被认为是膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌和胃癌等多种癌症的抑癌因子[15]。Liu等[16]研究表明，膀胱癌患者血清中miRNA-143表达水平明显低于健康人群，且miRNA-143表达水平与患者分化程度、淋巴结转移、远处转移和临床分期存在相关性，miRNA-143低表达患者平均生存时间短于miRNA-143高表达患者。郑新闻等[17]研究表明，miRNA-143是胰腺癌患者发病的保护因素，对评估患者病情及预后有一定价值。胡琛琛和张莉[18]报道指出，miRNA-143能下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，从而抑制食管癌细胞增殖。在本研究中，胆囊癌患者血清miRNA-143表达下调，其表达水平与患者分化程度、TNM分级有关，与He等[19]研究结果一致。He等[19]在体外实验中还发现，miRNA-143能通过下调HIF-1α显著抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，阻止上皮间质转化进程，这可能是本研究miRNA-143高表达患者3年生存率较高的原因。

胆囊癌患者大多预后不良，影响因素繁多。本研究Logistic多因素回归分析结果表明，TNM分级Ⅲ～Ⅳ级、淋巴结转移、miRNA-187高表达、miRNA-143低表达是胆囊癌患者3年生存率的独立危险因素。TNM分级、淋巴结转移对胆囊癌预后影响报道较多，在此不再赘述。胡菊梅和胡旻[20]报道miRNA-187高表达是卵巢癌患者不良预后的独立危险因素，并指出miRNA-187高表达可能增强胆囊癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，是胆囊癌的促癌因子，与本研究结果相似。miRNA-143能下调胆囊癌进展相关蛋白表达，在胆囊癌中起抑癌作用。因而，临床上联合检测miRNA-187与miRNA-143表达对评估胆囊癌患者预后具有重要意义。

综上所述，胆囊癌患者血清miRNA-187、miRNA-143表达与其分化程度、TNM分级有一定相关性，miRNA-187低表达、miRNA-143高表达患者3年生存率高，TNM分级Ⅲ～Ⅳ级、淋巴结转移、miRNA-187高表达、miRNA-143低表达是胆囊癌患者预后的独立危险因素。