高效液相色谱法测定化橘红(化州柚)配方颗粒中柚皮苷的含量

耿 硕

(颈复康药业集团有限公司，河北 承德 067400)

橘红以广东省化州市所产最为道地，称为化州橘红。因其药性辛、苦、温，主要用于散寒、燥湿、利气消痰，多用于止咳化痰立咽。化橘红配方颗粒(也称单方颗粒)是使用传统科学的中药炮制方法炮制的化橘红饮片为原料，采用先进科学的中药精选、提取、浓缩、干燥、制粒等加工技术精制而成的单方颗粒产品，该产品保留了原饮片的在配方颗粒剂中的主要功效与作用，方便医生在治疗过程中根据病情酌情加减，随症施治，它既保留了原药材的药性、药效，又不需要煎煮，服用方便，服用量少，吸收快，而它成分与原药材基本一致，疗效确切，安全卫生，携带保存方便，易于调配更主要的是适合工业化生产等诸多优点，深得医患认可。因橘红同类品种不同产地的较多，作用略有不同，为了筛选道地药材，控制化橘红配方颗粒的质量，我们选定柚皮苷为化橘红中药配方颗粒的特定成分，对配方颗粒中的柚皮苷做了含量测定研究，下面是是实验过程，试验结果显示，该方法简便，快速，准确，可作为化橘红配方颗粒含量的特定检测方法。

1 仪器试剂与对照品样品

高效液相色谱仪：仪器型号：Lab Alliance；检测器：Lab Alliance泵：Lab Alliance；色谱工作站：ANASTAR；Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，4.6×250mm)，具塞锥形瓶，容量瓶，万分之一天平等，试剂：甲醇为色谱纯试剂，水为超纯水；其它试剂均为色谱纯；对照品：柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所批号110826-201912)；样品：药品零售企业购买的华润三九医药股份有限公司生产的化橘红配方颗粒。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1色谱柱

色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，本实验采用Bonshell C18Plus 4.6mm*50mm ，2.7μm色谱柱。

2.1.2流动相的选择

参照《中国药典》2020年版一部第74页，“化橘红”含量测定项下的测定方法，以甲醇-醋酸-水(35:4:61)为流动相为流动相进行条件摸索，柚皮苷的分离度大于1.5，色谱峰对称性良好，故选用该流动相为本标准的流动相。

2.1.3柱温

30℃可以保证柱压较低，分离效果稳定，保留时间变化小。温度的变化，对柚皮苷出峰时间有影响，但对峰面积的影响较小。

2.1.4检测波长的选择

柚皮苷在283处有吸收峰，《中国药典》2020年版一部第74页，“化橘红”含量测定项下的测定方法，选用283nm处作为检测波长。

3)中速暖机结束，检查胀差、振动、汽缸温度等各参数无异常，高压内缸内壁温度大于200 ℃，汽缸热膨胀大于5 mm。选择升速率100 r/min2，机组过临界升速率自动变化为400 r/min2，升速至2000 r/min，高速暖机60 min。

2.1.5理论板数的确定

从对三批数据的测定结果可见，柚皮苷峰理论板数在1000以上，即能达到较好的分离效果,故规定理论板数按柚皮苷峰计算应不低于1000。

2.1.6对照品溶液的制备

精密秤取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml 含60μg的溶液，即得对照品溶液。

2.1.7供试品溶液的制备

取化橘红配方颗粒适量，充分混匀研细，取约0.10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇86ml，称定重量，水浴回流加热60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得供试液。

2.2 专属性考察

阴性对照试验；按正文[含量测定]项下的方法同法制备供试品溶液和对照品溶液。另取按相同工艺方法制备的不含化橘红药材的阴性对照样品，按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下,分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪进行测定。

图1 HPLC色谱图

2.3 线性关系考察

取柚皮苷对照品，精密称定12.0mg，置100ml量瓶，加甲醇制成每1m含0.10mg的溶液，作为对照品储备液。按照下表1进行稀释并稀准确释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液10μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，峰面积对进样量进行回归分析，结果柚皮苷在20～120μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为y=17929709.52x+ 13207.21，r=1.00。见表2、图2。

表1 柚皮苷标准曲线

表2 柚皮苷标准曲线数值表

图2 柚皮苷标准曲线图

2.4 精密度试验

取化橘红配方颗粒适量，混匀研细，取约0.10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇86ml，称定重量，水浴回流加热60分钟，放冷，称定重量，使用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度并摇勻，得供试液。连续进样6针，测定柚皮苷的含量，结果见表4。

表4 供试品溶液的精密度试验结果

结果表明，符合《中国药典》2020年版四部 通则0512中规定的RSD值远远小于2.0%的要求。

2.5 稳定性试验

对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取化橘红配方颗粒，混匀研细，取约0.10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇86ml，称定重量，水浴回流加热60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得供试液。取对照品溶液、供试品溶液分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h进行测定。结果见表5。

表5 不同时间测定对照品及供试品中柚皮苷的峰面积值

从表5中数据可以看出，柚皮苷在24小时内峰面积积分值基本恒定不变。能够满足测定所需要时间内的稳定性。

2.6 重复性试验

取同一批号化橘红配方颗粒供试品6份，各约0.10g，精密称定，分别按前述[含量测定]项下方法操作，测定每份供试品的含量，结果见表6。

表6 供试品中柚皮苷含量重复性试验结果

结果表明，供试品在相同的细度、相同的提取溶剂和色谱条件下，重复性较好。

2.7 加样回收试验

取已知含量 (批号：20201034-1，含量为131mg/g)的化橘红配方颗粒分成6份，混匀研细，取样品约0.02g，对照品约13.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇86ml，称定重量，水浴加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇勻，微孔滤膜滤过，各取续滤液10μl进样，分别按正文[含量测定]项下的色谱条件测定每份的含量，计算回收率，结果见表7。

表7 柚皮苷回收试验结果

结果：本方法的平均回收率为96.60 %，符合《中国药典》2020年版四部 9101“药品质量标准分析方法验证指导原则”中“表2 样品中待测定成分含量和回收率限度”的要求。

2.8 样品含量测定

取3批化橘红配方颗粒样品(批号：20201034-1,20201034-2 ,20201034-3)分别秤取约0.10g，各两份，精密称定，按前述[含量测定]项下的方法处理并测定，所得含量测定结果见表8。

表8 样品中柚皮苷的含量测定结果

从表8中的三批样品含量测定的数据可见，化橘红配方颗粒中含柚皮苷最低含量在130mg/g以上。考虑不同批次药材质量受各种因素影响含量会有差异，因此我们将化橘红配方颗粒中的柚皮苷含量下浮30%做参考含量，含量限度为130g×70%=91.0(mg/g)。通过以上试验论证，我们将化橘红配方颗粒中柚皮苷含量拟定为每1g化橘红配方颗粒中含柚皮苷(C27H32O14)不得少于91.0mg。

3 讨论

选取甲醇为溶媒，以柚皮苷提取量为考察指标，考察方法为： 取化橘红配方颗粒，混匀，研细，取约0.10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇86ml，称定重量，水浴回流加热60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇勻，即得供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

根据以上试验结果，样品中柚皮苷含量转移率为96.0%(大于95%),基本提取完全，因此本品的提取溶剂和提取方法是可以使用的。