蔓茎堇菜提取物提取工艺研究——以总黄酮提取工艺为例

吴敬燚 张如涯 陈金灶

（1.福建省大田职业中专学校，福建 三明 366100；2.福建省三明市竞源生物技术有限公司，福建 三明 366100）

蔓茎堇菜为堇菜科堇菜属植物，其化学成分主要有黄酮、萜类、糖类以及黏液质类等。其中，做为蔓茎堇菜的主要有效化学成分的黄酮，具有极大的药用价值，以全草入药，性凉微苦，具有清热解毒、散淤消肿、去腐生肌、清肺止咳之效。民间使用历史悠久，主治疮疡肿毒，眼结膜炎，肺热咳嗽，百日咳，黄疸型肝炎，水火烫伤，跌打损伤，毒蛇咬伤等。现代药理研究表明该植物具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、调节免疫功能、抗心肌缺血等药理活性。研究表明，蔓茎堇菜黄酮含量丰富，是工业化生产黄酮的良好材料。要实现蔓茎堇菜次生代谢物黄酮的工业化生产，必需确定其总黄酮的最佳提取方法。分别用热水、乙醇和甲醇为溶剂对样品进行提取，用紫外分光光度法于波长265nm处测定OD值，以芦丁标准品计算并比较各提取液总黄酮含量，从而确定蔓茎堇菜总黄酮的最佳提取工艺。

1 材料

芦丁（C27H30O16·3H2O），蔓茎堇菜样品为三明市大田县境内，仪器为紫外可见分光光度计，旋转蒸发仪。

2 总黄酮的提取方法

1）热水浸提法:称取样品干燥粉末(60目)10g，加入100ml(10倍量)蒸馏水，水浴回流1h，过滤后，滤渣重复浸提2次。合并滤液，减压浓缩至适量，放冷后，加醋酸乙酯振摇萃取(去除一些水溶性大的杂质如糖类)并定容至100ml，得总黄酮提取液。水浴温度分别取:70、85、100℃。

2）甲醇浸提法:称取样品干燥粉末(60目)10g，加入100ml(10倍量)甲醇，60℃水浴回流1h，过滤后，滤渣重复浸提2次。合并滤液，减压浓缩至适量，置冰箱中过夜。将浓缩液过滤并定容至100ml，得总黄酮提取液。甲醇溶液浓度分别取:70%，85%，100%。

3）乙醇浸提法:称取样品干燥粉末(60目)10g，加入100ml(10倍量)乙醇，80℃水浴回流1h，过滤后，滤渣重复浸提2次。合并滤液，减压浓缩至适量，置冰箱中过夜(使叶绿素沉淀)。将浓缩液过滤并定容至100ml，得总黄酮提取液。乙醇溶液浓度分别取:70%、85%、100%。

3 总黄酮含量的测定

分别吸取0.25ml上述各定容提取液于10ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，于265nm波长处测定OD值，试剂为空白参比，计算各提取液中总黄酮含量，即得率。计算公式如下:得率(以芦丁计)(%)=CV1V2(WV3)，式中C为样液中含黄酮量(mg)，V1为抽提定容体积(ml)，V2为由总黄酮提取液制备样液时所稀释倍数，W为称样量(mg)，V3为样液的定容体积(ml)。

4 结果分析

1）总黄酮的紫外吸收曲线。芦丁标准溶液和样品总黄酮提取液均在波长(265±10)nm处有最大吸收，且二者紫外吸收图谱基本一致，故以此为测定波长。

2）标准曲线绘制。以OD值对芦丁标准样品含量(gL)作图，标准曲线回归方程为y=0.00653+31.54x（如图1），其线性范围为0～0.1g，相关系数R=0.9998，经检验，差异极显著(t=240.616，P＜0.01)。

3）总黄酮含量的测定。样品测定结果可以看出，在热水浸提法中，总黄酮得率随着提取温度的升高而增加，但得率都极低，最高仅为0.104%.表2数据表明，甲醇浸提法所采用的3种浓度中，以85%的甲醇效果最好，平均达2.535%.乙醇浸提法所采用的三种浓度中，以用70%乙醇为溶剂时总黄酮得率最高，平均达2.773%.由于70%乙醇是所采用3种浓度中最低的，故再以40%及55%乙醇为溶剂进行补充实验。结果表明，5种浓度中以70%为最佳。比较数据表明，采用热水浸提法所得总黄酮得率与采用另两种方法相差两个数量级，显然不适用于蔓茎堇菜总黄酮的提取。采用有机溶剂乙醇或甲醇来浸提，总黄酮的得率都较高，但70%的乙醇显然优于85%甲醇，二者相比差异极显著(t=11.591，P＜0.01)。

图1 标准曲线

5 讨论

1）以上实验数据表明，提取温度、溶剂的种类和浓度均对总黄酮得率有显著影响。

2）采用热水浸提法，蔓茎堇菜总黄酮有一定的得率，但明显小于采用其它两种有机溶剂。游离黄酮、异黄酮一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中，但其糖甙由于增加了极性基团(-OH)，因而增加了其在水中的溶解度，减少了在有机溶剂中的溶解度。可以推断，蔓茎堇菜所含的黄酮只有少数以糖甙的形式存在，而大多以甙元的形式存在。

3）溶剂浓度是影响生产成本的关键因素。在上述几种梯度浓度中，甲醇和乙醇的浓度分别以85%和70%的效果最好，且总黄酮得率在最佳浓度的两侧呈递减趋势。采用较低浓度的溶剂来提取时，总黄酮得率反而可能比采用高浓度溶剂要高。采用55%和85%的乙醇时，二者总黄酮得率分别为2.368%和2.269%(t=3.531，P＜0.05)，但降低溶剂浓度就增加了溶剂中的水含量，同时导致蔓茎堇菜成分中糖类及粘液质的溶解度增加，从而使浓缩时间变长、过滤困难，使实验耗时明显增加。采用70%的乙醇为溶剂时上述影响不明显。

综上所述，由于采样的区域性和季节性因素对实验的准确性会造成影响，进一步通过把握样品采集和优化实验试剂及步骤，不断提高提取率，还有待今后继续研究。可以确定的是，工业化大量生产蔓茎堇菜黄酮类药用成分，可以侧重选用70%浓度的乙醇为提取溶剂的实验策略，从而切实提高提取的效率和效益。