白念珠菌群体感应分子法尼醇对巨噬细胞Ana-1和RAW264.7增殖、凋亡和迁移能力的影响①
2021-05-25胡万超朱俊峰周子阳唐建国
胡万超 王 丹 朱俊峰 周子阳 唐建国
(复旦大学附属上海市第五人民医院急危重症医学科,上海200240)
白念珠菌是一种常寄居于人体呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道的条件致病菌,免疫缺陷个体中,白念珠菌可穿过宿主保护膜定植于内脏器官引发感染,甚至危及生命[1-3]。白念珠菌分为菌丝相和酵母相,其致病状态主要是菌丝相,菌丝相形成的生物膜可固定于固体表面,易于其定植与侵袭,且与耐药性密切相关[4-7]。法尼醇是白念珠菌生成的群体感应分子,可抑制白念珠菌酵母相向菌丝相转换,从而抑制生物膜形成[8-9]。研究发现,法尼醇联合氟康唑可协同抑制生物膜形成,在降低白念珠菌耐药性方面有广阔应用前景[10-12]。法尼醇也可通过促进ROS产生和破坏线粒体诱导哺乳动物、真菌和细菌细胞凋亡[13]。但其生物学机制尚未阐明。
宿主抵抗白念珠菌定植及侵袭过程中,机体固有免疫和适应性免疫发挥重要作用[14-15]。巨噬细胞在固有免疫和适应性免疫过程中均起重要作用,不仅可作为效应细胞吞噬和杀灭白念珠菌,还可作为抗原提呈细胞激活适应性免疫,诱导促炎症细胞因子释放,如TNF-α、IL-6等,从而诱导Th1细胞免疫反应[16-17]。研究显示,法尼醇可增加巨噬细胞趋化,当白念珠菌被趋化的巨噬细胞吞噬3~6 h后,白念珠菌可形成菌丝穿透巨噬细胞,引发免疫逃逸[18-19]。研究发现,法尼醇可影响单核细胞、中性粒细胞、未成熟的树突状细胞表面标志物表达,但其对巨噬细胞的具体生物学效应尚未明确[19]。本研究在细胞水平观察法尼醇对巨噬细胞RAW264.7和Ana-1增殖、凋亡、迁移的影响,发现法尼醇可抑制巨噬细胞增殖,促进巨噬细胞凋亡和迁移,其机制可能为法尼醇趋化巨噬细胞后,其毒性作用抑制巨噬细胞增殖的同时激活程序性凋亡通路,对进一步研究白念珠菌如何从巨噬细胞逃逸并破坏巨噬细胞具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验细胞 巨噬细胞RAW264.7和Ana-1购自中国科学院干细胞库。
1.1.2 主要试剂 法尼醇购自美国Sigma公司;CCK-8试剂盒购自上海碧云天公司;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITc)凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司;0.22µm和0.45µm PVDF膜购自德国Millipore公司;鼠单克隆抗体β-ac⁃tin、兔单克隆抗体GAPDH购自美国CST公司;AKT兔单克隆抗体、P-AKT兔单克隆抗体购自英国Abcam公司;PARP兔单克隆抗体、Caspase-3兔单克隆抗体、Caspase-9兔单克隆抗体购自美国Proteintech公司;兔二抗和鼠二抗购自美国Jackson ImmunoResearch公司;Transwell小室购自美国Corning公司。
1.1.3 主要仪器 流式细胞仪购自美国BDBiosci⁃ence公司;WB电泳、转膜系统购自美国Bio-Rad公司;酶联免疫检测仪购自瑞士Tecan集团;倒置显微镜购自美国莱卡公司;超净工作台、离心机、超低温冰箱、37℃培养箱均购自美国Thermo Fisher公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 RAW264.7巨噬细胞未用药物处理前采用DMEM培养基+10%胎牛血清培养,Ana-1采用1640培养基+10%胎牛血清培养,培养条件为5%CO2、37℃,生长至80%~85%融合时,采用细胞刮刮下RAW264.7细胞,移液枪吹下Ana-1细胞,传代2~3 d。药物处理时采用无血清培养基培养以防止血清与法尼醇反应而影响药物效果[20-21]。实验分为对照组及不同浓度法尼醇处理巨噬细胞组。对照组给予1‰DMSO,实验组给予RAW264.7和Ana-1各自半数抑制浓度(IC50)及其以下浓度法尼醇,CCK-8法检测并计算IC50,因此处理RAW264.7巨噬细胞分为对照组、法尼醇5、15、25µmol/L组;法尼醇处理Ana-1巨噬细胞分为对照组、法尼醇5、15µmol/L。
1.2.2 CCK-8法检测细胞生长抑制率 取对数生长期RAW264.7细胞和Ana-1细胞,分别用细胞刮和吹打方式消化细胞,PBS洗涤,离心,取细胞沉淀,制备1×105个/ml单细胞悬液,100µl/孔接种至96孔板培养24 h,吸净培养基,PBS洗涤,加入无血清培养基配制的相应浓度法尼醇,各浓度设3个复孔,继续培养4 h,10µl/孔加入CCK-8溶液孵育3 h,酶标仪测定450 nm处各孔吸光度并计算均值。法尼醇IC50测定:不同浓度法尼醇处理巨噬细胞RAW264.7和Ana-1,观察1 h、4 h细胞存活情况,计算细胞活性,细胞活性=(存活率实验组-存活率空白组)/(存活率对照组-存活率空白组)×100%,GraphPad Prism8.0.2软件计算并进行线性拟合得到IC50及相关曲线。
1.2.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测 取对数生长期RAW264.7细胞和Ana-1细胞,制备5×105个/ml单细胞悬液并接种至小皿,1 ml/孔加入4 ml培养基培养24 h,PBS洗涤,按预先设置的分组给予相应浓度法尼醇继续培养4 h,胰酶消化并收集细胞,PBS洗2次,弃上清,100µl/管加入结合缓冲液重悬细胞,加入Annexin V试剂5µl和PI试剂10µl,混匀,避光孵育15 min,流式细胞术检测。
1.2.4 Western blot检测 接种至小皿的各组细胞培养24 h,PBS洗涤,采用不同浓度法尼醇处理4 h,提取细胞总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度,30µg蛋白上样,进行SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加入一抗,4℃孵育过夜,TBST洗3次,15 min/次,加入二抗,室温孵育2 h,洗涤3次,ECL化学试剂发光,曝光,Image J软件进行半定量检测。
1.2.5 Transwell检测 取对数生长期细胞,RAW 264.7细胞制备5×105个/ml细胞悬液,Ana-1细胞制备2×105个/ml细胞悬液,各组上室加入100µl细胞悬液,按实验分组,下室加入由培养基(不含血清)配制的相应浓度法尼醇溶液600 ml,5%CO2、37℃培养,RAW264.7细胞培养24 h,Ana-1细胞培养72 h,4%多聚甲醛溶液固定30 min,结晶紫染色30 min,ddH2O冲洗上室内未迁移的细胞并用棉签擦掉,自然干燥,显微镜下观察并拍照。
1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism8.0.2软件进行统计学分析,数据以±s表示,两组间比较采用Student′st检验,多组间比较采用完全随机设计的单因素分析(Oneway-ANOVA),组间两两比较采用Dun⁃nett′st检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 法尼醇对RAW264.7和Ana-1巨噬细胞的IC50检测 随处理时间延长和浓度增加,法尼醇对RAW264.7和Ana-1巨噬细胞增殖的抑制作用越发显著(图1),法尼醇作用于RAW264.7巨噬细胞1 h和4 h的IC50分别为(48.95±1.49)µmol/L、(26.1±0.65)µmol/L,不同时间点IC50值差异有统计学意义(t=14.55,P<0.05)。法尼醇作用于Ana-1巨噬细胞1 h和4 h的IC50分 别 为(23.29±0.33)µmol/L、(17.19±0.93)µmol/L,不同时间点IC50值差异有统计学意义(t=6.182,P<0.05)。
图1 法尼醇对巨噬细胞活性的影响Fig.1 Effect of farnesol on macrophages viability
2.2 法尼醇对RAW264.7和Ana-1巨噬细胞凋亡的影响 与对照组[(8.54±0.43)%]相比,5、15、25µmol/L法尼醇处理组RAW264.7细胞凋亡率分别 为(32.79±5.34)%、(39.32±2.42)%、(52.31±1.80)%,差异具有统计学意义(P<0.001)。与对照组[(5.71±1.10)%]相比,5、15µmol/L法尼醇处理组Ana-1细 胞 凋 亡 率 分 别 为(17.81±1.05)%、(32.73±3.31)%,差异具有统计学意义(P<0.001)。随法尼醇浓度增加,作用于巨噬细胞4 h后凋亡率提高,提示法尼醇可促进巨噬细胞凋亡(图2)。
图2 法尼醇对巨噬细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of farnesol on apoptosis of macrophages
2.3 法尼醇对巨噬细胞凋亡相关蛋白表达的影响 不同浓度法尼醇可促进巨噬细胞凋亡,进一步检测经典的凋亡通路AKT/BCL-2/Caspase-9/Cas⁃pase-3/PARP,结果显示,与对照组相比,不同浓度法尼醇作用于RAW264.7和Ana-1巨噬细胞4 h后,随法尼醇浓度增加,RAW264.7巨噬细胞中,仅有采用最高浓度法尼醇处理时,磷酸化AKT(P-AKT)表达明显下降(P<0.01)。Ana-1巨噬细胞中,随法尼醇浓度增加,P-AKT表达下降,呈浓度依赖性,与对照组差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。AKT可激活Bcl-2抑制细胞凋亡,进一步检测不同浓度法尼醇处理巨噬细胞后Bcl-2蛋白表达,2种巨噬细胞中Bcl-2表达降低,除采用5µmol/L法尼醇处理Ana-1细胞时,Bcl-2表达与对照组差异无统计学意义,其余各组差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.001,图3)。进一步检测促进细胞凋亡的另一经典家族Caspase家族蛋白表达,同时由于PARP蛋白作为底物既可被Bcl-2抑制,又可被Caspase蛋白剪切,故检测PARP蛋白表达,结果如图4所示,PARP和PARP剪切带(Cleaved PARP)表达在2种巨噬细胞中呈相反趋势,PARP表达逐渐减少,Cleaved PARP表达逐渐增加,与对照组差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。Caspase-9剪切带(Cleaved Caspase-9)在RAW264.7巨噬细胞中仅有采用最大浓度(25µmol/L)法尼醇处理时表达明显增加(P<0.001),在Ana-1巨噬细胞中,与对照组相比,法尼醇处理组Cleaved Caspase-9表达增加(P<0.05,P<0.001)。Caspase-3主带在2种巨噬细胞中的表达与法尼醇处理无关,而Cleaved Caspase-3随法尼醇浓度增加,表达逐渐增加(P<0.01,P<0.001),呈剂量依赖性(图5)。各凋亡蛋白在2种巨噬细胞中表达趋势基本一致。
图3 法尼醇对巨噬细胞AKT、P-AKT、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.3 Effect of farnesol on expressions of AKT,P-AKT,Bcl-2 proteins in macrophages
图4 法尼醇对巨噬细胞PARP、Cleaved PARP、Cleaved Caspase-9蛋白表达的影响Fig.4 Effect of farnesol on expressions of PARP,Cleaved PARP,Cleaved Caspase-9 proteins in macrophages
2.4 法尼醇对巨噬细胞迁移的影响 为研究白念珠菌分泌法尼醇后,法尼醇能否趋化巨噬细胞诱导巨噬细胞凋亡,进一步采用不同浓度法尼醇处理巨噬细胞以验证其迁移能力,结果显示,与对照组相比,不同浓度法尼醇可促进RAW264.7和Ana-1巨噬细胞迁移,且呈剂量依赖性,各组间差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.001,图6)。
图5 法尼醇对巨噬细胞Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响Fig.5 Effect of farnesol on expressions of Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 proteins in macrophages
图6 法尼醇对巨噬细胞迁移的影响Fig.6 Effect of farnesol on migration of macrophages
3 讨论
念珠菌是引起院内血流感染的第4大原因,随抗生素、肿瘤患者及器官移植患者免疫抑制剂应用增多,白念珠菌感染增多,真菌耐药性日趋严重[22]。目前临床应用最多的抗白念珠菌药物主要为棘白菌素类、唑类、多烯类及核苷酸类似物,但并不能完全抑制白念珠菌生物膜形成,导致白念珠菌对传统抗真菌药物耐药性增加[23-26]。法尼醇作为白念珠菌分泌的群体感应分子,可抑制白念珠菌生物膜形成,与传统抗真菌药物联用可减少耐药性发生,但其对白念珠菌侵袭和感染的作用机制尚未明确。
机体抵御白念珠菌感染时,巨噬细胞在固有免疫和激活适应性免疫中起重要作用,当白念珠菌进入机体时,巨噬细胞可识别、吞噬病原体和招募其他免疫效应细胞,但白念珠菌分泌的法尼醇如何影响巨噬细胞尚未明确,本研究采用2种巨噬细胞RAW264.7和Ana-1探究法尼醇对巨噬细胞的影响。
研究显示,白念珠菌生物膜形成可破坏巨噬细胞,巨噬细胞也可影响生物膜形成[27-28]。法尼醇可抑制生物膜形成,同时作为白念珠菌的毒力因子导致小鼠巨噬细胞活性下降,引发白念珠菌传播[19]。本研究采用CCK-8法确定不同浓度法尼醇在不同时间处理RAW264.7和Ana-1巨噬细胞的IC50,结果发现随时间延长,IC50逐渐降低,法尼醇处理巨噬细胞RAW264.7 4 h的IC50为25µmol/L,处理Ana-1 4 h的IC50为15µmol/L,均在白念珠菌分泌法尼醇的生理浓度范围内(2~60µmol/L)[15,19-20]。提示白念珠菌分泌的法尼醇浓度足以抑制巨噬细胞增殖活性,因此本研究采用生理浓度的法尼醇更能反映白念珠菌和机体免疫细胞的相互作用。
巨噬细胞迁移对发挥吞噬作用具有重要作用,研究显示,法尼醇可促进RAW264.7巨噬细胞迁移[21]。本研究采用Transwell法分析RAW264.7和Ana-1巨噬细胞迁移,发现随生理剂量法尼醇浓度增加,巨噬细胞迁移能力增强。当白念珠菌分泌法尼醇后,可促进巨噬细胞进一步迁移接近白念珠菌,但同时法尼醇可降低巨噬细胞活性,因此课题组进一步研究法尼醇是否可通过凋亡途径抑制巨噬细胞增殖。
细胞凋亡是细胞受基因调控的程序性死亡过程,其途径主要包括死亡受体途径和线粒体途径,Bcl-2蛋白家族主要参与后者调控,作为Caspase的抑制因子抑制细胞凋亡。Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3/PARP通路是细胞凋亡的经典途径之一,本研究对Bcl-2蛋白的表达情况进行分析,发现随法尼醇浓度增加,Bcl-2表达逐渐减少,而促凋亡蛋白Cas⁃pase-3、Caspase-9和PARP剪切带表达均随法尼醇浓度增加而增加,由于AKT既可通过促进Bcl-2也可以通过抑制Caspase-9抑制细胞凋亡,故检测AKT及P-ATK蛋白表达情况,发现随法尼醇浓度增加,PAKT表达减少,因此,法尼醇可能通过影响和激活AKT、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cleaved PARP和PARP表达促进RAW26.7和Ana-1巨噬细胞凋亡。同时流式实验也展现了法尼醇对巨噬细胞的凋亡作用。
巨噬细胞与白念珠菌的相互关系目前尚未阐明,正常免疫情况下,巨噬细胞可吞噬清除白念珠菌,免疫低下时,白念珠菌可借助巨噬细胞进行扩散,白念珠菌的群体感应分子法尼醇可抑制其生物膜形成,课题组研究法尼醇对巨噬细胞生物活性的影响结果显示,法尼醇也可能通过抑制巨噬细胞生长促进巨噬细胞凋亡和迁移影响白念珠菌增殖。当白念珠菌入侵机体时,其分泌的法尼醇可趋化巨噬细胞,从而导致白念珠菌被巨噬细胞吞噬,降低巨噬细胞活性,诱导巨噬细胞凋亡,同时白念珠菌菌丝穿透巨噬细胞质膜引发免疫逃逸。因此研究法尼醇与巨噬细胞的关系可能对治疗白念珠菌感染具有重要意义,其作用机制和有待进一步研究。