SR9009对人胶质母细胞瘤T98G细胞作用的研究

马辰，王堃，马云胜，单伟

(1.锦州医科大学人体解剖学教研室，辽宁 锦州 121000；2.盘锦市中心医院急诊科，辽宁 盘锦 124000)

多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是以胶质样肿瘤细胞异常增殖生长为特征的最具侵袭性的人类脑肿瘤之一。目前已知生物节律的改变常常会导致多种病理情况出现，研究表明机体昼夜节律紊乱是增加患癌症和代谢紊乱疾病的风险之一[1]。虽然人们对肿瘤固有的昼夜节律功能知之甚少，但是通过对一些与生物节律有关成分的研究发现，调节这些成分有可能为癌症的预防和治疗提供新的选择[2]。人胶质母细胞瘤T98G细胞就是作为研究肿瘤细胞固有生物节律的一个癌细胞模型。

吡咯衍生物SR9009是一种特异性REV-ERB激动剂，近年来对其生物学特性以及靶向治疗生物昼夜节律紊乱(比如肥胖、血脂异常、葡萄糖耐受不良、睡眠障碍和癌症)研究发现：其对生物昼夜节律的药理学调节主要是通过抑制细胞中异常激活的通路从而影响细胞的生存能力。研究表明激活REV-ERB受体激动剂SR9009，对小鼠体内代谢同样产生了影响：如在不改变动物的运动量或食物摄入量条件下的食源性肥胖鼠的体重减轻[3]。考虑到REV-ERBs对脂质、葡萄糖和能量代谢调节的作用以及癌细胞的高代谢需求，我们人为：对生物节律成分——REV-ERB的药理学调节可能会改变癌细胞生存的代谢途径。因此，本实验拟采用SR9009处理对T98G细胞，并将其与BOR对照治疗进行比较，评估其对肿瘤细胞生存能力的影响，同时观察在模拟使用地塞米松(dexamethasone，DEX)后不同时间段的药物敏感反应期，以及观察其对细胞代谢水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

多形性胶质母细胞瘤T98G细胞株，购置于上海细胞库。所有实验操作符合锦州医科大学实验伦理委员会批准并符合相关要求。SR9009，BOR购于深圳华莱生物科技公司；DMEM，FBS购于Gibco公司；兔抗谷氨酰胺合成酶，兔抗GFAP，兔抗REV-ERBα，GFP/CY3二抗试剂盒、MTT(噻唑蓝)检测试剂盒购于北京博奥森公司。

1.2 细胞培养

人多形性胶质母细胞瘤T98G细胞复苏后，接种于75 cm2的培养瓶中，采用DMEM培养基，添加10%胎牛血清(FBS)，于37 ℃，5% CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱内培养。每3天换液1次，待细胞融合后进行消化传代。应用恢复活力的第二代细胞进行以下实验。

1.3 MTT法测定SR9009对肿瘤细胞活力的影响

第二代T98G细胞以1×104密度接种于96孔细胞培养板中，37 ℃下过夜。次日，培养的细胞分别与DMSO和10、20、40 μM 下REV-ERB激动剂SR9009共同孵育，孵育时间分别为24、48、72 h。孵育后，向每个孔中加入10 μL二苯基四唑溴化铵(MTT，5 mg/mL)，37 ℃ 孵育2 h。然后，向每个孔中加入100 μL DMSO-异丙醇(1∶1)混合液，在室温下避光孵育10 min。样品以650 nm波长激发，在570 nm波长下用的微孔板酶标仪进行分析。将DMSO处理细胞活力设定为100%。

1.4 SR9009对T98G细胞活力的时间影响效应观察

T98G细胞以1×104密度接种于96孔板中，在37 ℃，饱和湿度的CO2培养箱中孵育过夜。次日，向每孔内添加100 nM 地塞米松后与细胞培养20 min，然后以每6个孔为1个单位，分别按照每6个小时间隔(0、6、12、18、24、30、36 h)，依次添加20 μM的SR9009或500 nM的BOR进行孵育。最后，按照前面所述方法，用MTT法测定细胞活力，在570 nm处用微孔板酶标仪进行对照分析。同样以DMSO处理的细胞活力作为100%。

1.5 SR9009对T98G细胞周期影响的分析

T98G细胞分别与DMSO和SR9009(20 μM) 在无血清DMEM中孵育后36 h。然后，去除培养基，向DMEM培养基内添加20%FBS，继续应用DMSO或SR9009孵育细胞16 h。最后，胰蛋白酶消化并收集细胞，冷PBS洗涤，在20 ℃下用70% 乙醇固定24 h。细胞重悬于150 mL含50 mg/mL碘化丙啶和10 mg RNAse A的PBS染色液中。分别取5×104个细胞行流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 流式细胞术检测SR9009或BOR单独用药对肿瘤细胞氧化还原状态的影响

20 μM SR9009和500 nM BOR 分别与T98G细胞孵育48 h和24 h，同时用40 μM SR9009与HepG2细胞孵育48 h。然后去除培养基，用冷PBS 洗涤细胞，胰酶消化并收集细胞。细胞与2 μM浓度活细胞荧光示踪探针二乙酸荧光素(FDA)在37 ℃下孵育40 min，PBS洗涤2次，样本在485 nm波长光激发，用流式细胞术检测530 nm处的荧光强度。阴性对照为无荧光指示剂的细胞，用50 mg/mL碘化丙钠染色鉴别活细胞。使用Flow Jo软件分析荧光强度。

1.7 药物联合处理对T98G细胞的协同作用观察

在37 ℃下将T98G细胞置于含100 nM 地塞米松和5% FBS的DMEM培养基中预孵育20 min。然后采用以下单独或联合不同浓度药物与细胞共孵育：(1)单独SR9009低(10 μM)和高剂量组(20 μM)；(2)单独BOR低(50 nM)和高剂量组(500 nM)；(3)联合BOR(50 nM)+SR9009(10 μM)低剂量组；(4)联合高剂量组BOR(500 nM)+SR9009(20 μM)。然后37 ℃孵育36 h。MTT法分析细胞活力。

1.8 免疫组织化学检测

培养细胞的盖玻片在含4%多聚甲醛PBS中固定15 min，PBS冲洗2次，用封闭缓冲液(PBS中加入0.1% 牛血清白蛋白、0.1% 吐温20和0.1% 甘氨酸)处理10 min，分别滴加一抗(兔抗谷氨酰胺合成酶、波形蛋白、GFAP、REV-ERBα)，并在4 ℃冰箱内过夜。次日，取出盖玻片并洗涤3次，与CY3或GFP标记的抗兔免疫球蛋白(IgG，1∶500)室温孵育1 h。DAPI染色细胞核，冲洗盖玻片，梯度酒精脱水，封片，共聚焦显微镜观察。

1.9 统计学方法

2 结 果

2.1 SR9009对T98G细胞活力和形态的影响

免疫细胞化学方法发现：人T98G细胞表达了波形蛋白(Vimentin)、谷氨酰胺合成酶(GS)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)这些典型的胶质细胞标志物以及生物钟成分蛋白REV-ERBa，见图1A～图D。此外，与DMSO对照组相比，细胞与不同浓度(10、20、40 μM)SR9009在不同时间(24、48、72 h)处理后，随着药物浓度增加和孵育时间的延长细胞形态受到了显著影响，可见细胞体积萎缩变小，胞核和胞质均减小，尤其是胞质减少明显，见图1E～图1F。MTT法显示浓度为10 μM的SR9009处理的T98G细胞活力与20 μM或40 μM处理的细胞活力差异明显；而SR9009处理24 h与处理48、72 h的细胞活力也不同。在20、40 μM 浓度分别孵育48、72 h的时候细胞活力明显下降(P<0.01)，见表1、图2。尤其是与20、40 μM的SR9009孵育72 h后，有活性细胞仅剩下约20%左右。

A:绿色为T98G细胞表达的波形蛋白；B：绿色为T98G细胞表达的谷氨酰胺合成酶；C：T98G细胞与DMSO孵育48 h，红色荧光为GFAP表达；D：T98G细胞与DMSO孵育48 h，REV-ERBa 呈绿色荧光；E：T98G细胞与SR9009 孵育48 h，GFAP呈红色荧光；F：T98G细胞与SR9009孵育48 h，REV-ERBa呈绿色荧光。标尺：10 μm；VIMENTIN：波形蛋白；GFAP：胶质原纤维酸性蛋白；GS：谷氨酰胺合成酶

表1 MTT法测试SR9009对T98G细胞活力的影响

SR9009浓度和处理时间对T98G细胞活力均有显著差异；◇P<0.01；与24 h组比较，△P<0.01；与48 h比较，☆P<0.01，n=6

2.2 SR9009、BOR处理时间对T98G细胞活力的影响

MTT法分析SR9009(20 μM)处理不同的时间对T98G细胞活力的影响，结果显示出明显的药物处理时间效应。T98G细胞活力水平随药物处理时间变化而变化，孵育6 h与孵育18、24、30 h有显著差异。即在SR9009处理18～30 h时间段内细胞活力为最低水平，在该时间段内药物对细胞活力的影响也最明显(P<0.05)，见图3A。和SR9009相似，使用BOR(500 nM)处理的T98G细胞同样发现细胞活力存在显著的时间效应。与6 h相比，在共孵育后的12～24 h时间段内细胞活力为最低(P<0.01)，见图3B。

2.3 SR9009对T98G细胞周期的影响

流式细胞术分析显示，经20% FBS刺激，SR9009处理后的T98G细胞58.2%处于G0/G1期，而DMSO处理后的细胞只有43.3% 处于G0/G1期(P<0.01)。相反，经DMSO处理的细胞中，S期细胞比例为40.1%，远高于经SR9009处理的细胞的22.6%(P<0.05)，见图4。

2.4 SR9009对T98G细胞氧化还原和脂质代谢的影响

用流式细胞术测量荧光强度显示：与DMSO对照组相比，20 μM 浓度SR9009处理的T98G细胞ROS水平显著降低(P<0.01)，见图5A。相反，与DMSO对照组细胞相比，与500 nM浓度的BOR孵育24 h的T98G细胞中ROS水平明显升高(P<0.05)，见图5B。

A：MTT法检测不同时间添加20 μM浓度的SR9009与地塞米松(100 nM)共同处理的T98G细胞后不同时间段的细胞活力；B：MTT法测定BOR(500 nM)和地塞米松处理的T98G细胞在不同时间段的细胞活力，*P<0.05，#P<0.01，n=6。BOR=硼替佐米

A：DMSO处理组细胞周期；B：SR9009处理组细胞周期图；C：DMSO和SR9009处理对T98G细胞周期影响统计图。SR9009组在G0/G1期比例更高，G0/G1 *P<0.01；S *P<0.05，n=6

A:使用SR9009(20 μM，48 h) 处理T98G细胞；B：使用BOR(500 nM，24 h)处理T98G细胞。SR9009、BOR与DMSO处理的细胞相比有显著性差异，**P<0.01，*P<0.05，n=6

2.5 SR9009和BOR联合应用对T98G细胞协同作用结果

通过MTT测定细胞活力发现：当单独给予低浓度BOR(50 nM)或SR9009(10 μM)处理时，细胞存活率仍能达到60%；然而，与每种药物单独处理相比，低浓度联合(BOR 50 nM +SR9009 10 μM)处理后，细胞活力下降到28%(P<0.01)，见图6A。此外，当单独给予高浓度BOR(500 nM)或SR9009(20 μM)药物处理后，细胞存活率分别为28%和34%。然而，当两种药物同时联合以高剂量(BOR 500 nM+SR9009 20 μM)应用于T98G细胞时，细胞存活率显著降低，细胞活力下降到17%(P<0.001)，见图6B。可见两种药物联合具有重要的协同增效作用。

与单独药物处理的细胞相比：**P<0.01，***P<0.001，n=6

3 讨 论

现代人的一些生活习惯—如轮班、时差等可能会导致机体昼夜节律紊乱，从而增加患癌症和代谢紊乱疾病的风险[4]。虽然人们对肿瘤固有的昼夜节律功能知之甚少，但是通过对一些与生物节律有关成分的研究发现，调节这些成分有可能预防和治疗癌症。REV-ERBs是血红素结合的生物节律蛋白成分，它是肿瘤发生过程(如新陈代谢、增殖和炎症)的抑制因子[5]。SR9009作为REV-ERBs特异性的激动剂，是一种合成的吡咯衍生物。在对小鼠的初步试验表明，它可以使肌肉和新陈代谢率增加，运动时耐力增强。此外，它还可以降低胆固醇，减少炎症和焦虑[6]。

本研究表明，SR9009对肿瘤固有生物节律蛋白成分的调节对肿瘤细胞的代谢具有重大影响，它对胶质瘤细胞产生了一定的细胞毒性作用。这些观察结果表明，通过调节胶质母细胞瘤细胞特定的生物节律钟成分(如调节REV-ERBs代谢)可以发挥明显的抗肿瘤治疗作用。SR9009通过减少ROS生成改变了胶质细胞典型的形态、细胞生存能力和新陈代谢水平。本研究中发现与SR9009的联合治疗进一步增强了BOR的作用效果。然而，我们也发现这两种药物发挥抗肿瘤的作用机制似乎不同，BOR抑制蛋白酶体功能，而SR9009作用于与生物节律钟相关的细胞代谢功能。同时，这两种药物都表现出具有一个对细胞产生药物治疗最高敏感性的作用时间段，即从12～18 h到24 h。

本研究结果表明，REV-ERB激动剂明显影响了细胞周期，因为与DMSO对照组细胞相比，SR9009处理的细胞中约有60%处于G0/G1期。我们探讨了联合治疗是否能改善或增强治疗效果。为此，本实验采用了BOR(50 nM或500 nM)，SR9009(10 nM或20 μM)单独处理T98G细胞，以及低浓度(50 nM BOR+10 μM SR9009)和高浓度组合(500 nM BOR+20 μM SR9009)孵育T98G细胞36 h，通过MTT测定细胞活力。我们发现了两种药物具有良好的协同作用，因此在适当的时间阶段采用两种药剂的联合治疗可以实现以较低的单独剂量获得更好的疗效[7]。

本研究发现BOR和SR9009这两种药物影响氧化还原状态的机制似乎不同，因为研究中发现BOR诱导ROS水平升高，而SR9009处理后细胞中ROS水平下降。尽管BOR抑制蛋白酶体后导致细胞凋亡等后续机制尚不清楚。此外，在结直肠癌和人H460非小细胞肺癌细胞以及人白血病细胞中也观察到BOR处理后的细胞中ROS水平升高[8-9]。相反，SR9009处理的细胞与未处理的细胞相比，两种肿瘤细胞系的ROS水平都降低。这些结果与Sulli等人提出的观点一致，即癌细胞对SR9009治疗的敏感性增强与ROS的生成增加无关[10]。