IL-17信号通路在回归热神经性疏螺旋体病中的作用

程美慧 陆 巍 张 静 丁开云 刘红旗

中国医学科学院 北京协和医学院医学生物学研究所感染和免疫实验室，云南昆明 650118

回归热神经性疏螺旋体病（relapsing fever neuroborreliosis，RFNB）是由回归热疏螺旋体感染引起的一种中枢神经系统疾病综合征[1]，这种感染的特征是使患者反复出现高热和菌血症，甚至出现中枢神经系统疾病[2-4]。前期研究发现[5]，回归热疏螺旋体感染后，小鼠中枢神经系统症状的出现与T淋巴细胞有关，但是确切的致病机制还不清楚。

白细胞介素（IL）-17是T细胞和先天免疫细胞分泌的细胞因子[6-8]。IL-17细胞因子家族包括IL-17A～F 6个细胞因子[9-10]，其中IL-17A为该家族的主要成员，参与了多种感染与免疫相关疾病[11-13]。研究显示[14]，IL-17可诱导实验性变态反应性脑脊髓炎中枢神经系统疾病的产生。另外，莱姆病螺旋体感染引起的莱姆病可通过抑制IL-17来预防关节炎的发生[15-18]。但是，IL-17信号通路是否与RFNB的发生有关目前鲜见相关研究。

前期研究发现C57BL/6小鼠是研究RFNB最理想的小鼠模型[19]。另外，DAH菌株由于能在免疫正常的小鼠体内快速复制，因此被广泛地用于动物模型研究[5]。本研究在前期研究的基础上，探索IL-17信号通路在回归热疏螺旋体感染诱导的中枢神经系统疾病中的作用，以期为该病的治疗提供一定的理论基础和指导。

1 材料与方法

1.1 菌种

回归热疏螺旋体DAH株由美国托马斯杰斐逊大学医学院根据美国国立卫生研究院的协议馈赠。

1.2 实验动物

C57BL/6野生型小鼠共14只，雌雄各半，由中国医学科学院医学生物学研究所小实验动物部提供，实验动物生产许可证SCXK（滇）K2014-0002。IL-17信号通路缺陷（IL-17-/-）小鼠（C57BL/6背景）共8只，雌雄各半，来源于日本东京理工大学生物医学研究所动物疾病模型中心。所有小鼠均为健康8～12周龄清洁级小鼠，体重18～22 g。于室温（20～25℃）条件下饲养，标准鼠食，自由饮水。

1.3 主要仪器和试剂

BSK-H培养基（货号：B8291）购于美国Sigma公司；10%中性福尔马林固定液（货号：E672001）购于BBI Life Sciences公司；DPBS（货号：SH30028.02）购于HyClone公司；IgG酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（批号：E90-131-38）和IgM ELISA试剂盒（批号：E90-101-33）均购于Bethyl公司；酶标仪购于TECAN公司；暗视野显微镜购于Nikon公司；3DHISTECH数字切片扫描仪；抗凝剂（1× ACD溶液）由感染和免疫实验室制备。

1.4 方法

1.4.1 实验动物分组 8只IL-17-/-小鼠为IL-17-/-组；将14只C57BL/6野生型小鼠随机分为两组，第一组（S组）为6只，作为前期观察，实验结束后进行安乐死；第二组（E组）为8只，作为IL-17-/-组的对照，感染后第14天解剖，取脾脏和脊髓做病理分析。

1.4.2 实验动物感染 将螺旋体用BSK-H培养基稀释成5个/HPF，用1 mL注射器吸取200 mL螺旋体通过腹腔注射感染小鼠。

1.4.3 血液样品的采集和处理 感染前后，每天采小鼠尾静脉血5 μL，用45 μL 1×ACD抗凝剂稀释后，吸取5 μL置于载玻片上，通过暗视野显微镜观察并记录血液内菌体数量，之后将血液样品保存于-80℃冰箱。

1.4.4 小鼠血液内螺旋体特异性IgG和IgM含量测定从-80℃冰箱内取出“1.4.3”中保存的血液样品，采用双抗体夹心ELISA法测定小鼠血液内IgG和IgM的含量，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。每组设2个复孔，实验重复3次。

1.4.5 神经症状观察 每天对感染回归热疏螺旋体小鼠的中枢神经系统疾病症状评分[20]：“0”为无明显神经症状；“1”为尾巴无力或一后肢无力；“2”为双后肢无力；“3”为一后肢麻痹；“4”为双后肢麻痹；“5”为因神经疾病引起死亡。

1.4.6 组织病理学分析 在回归热疏螺旋体感染后第14天用CO2麻醉E组和IL-17-/-组小鼠，用DPBS进行心脏透析后解剖小鼠，取出脊髓，用10%中性福尔马林固定液固定后进行包埋、切片和苏木精-伊红（HE）染色，之后用3DHISTECH数字切片扫描仪进行切片扫描。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 8统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 回归热疏螺旋体感染S组小鼠血液中螺旋体数、特异性抗体发生情况及神经系统发病情况

用回归热疏螺旋体DAH菌株感染S组小鼠，发现小鼠体内有效地复制扩增并引起菌血症（图1A），产生螺旋体特异性IgG和IgM（图1B）。用回归热疏螺旋体DAH菌株感染S组小鼠，从感染后第8天开始，小鼠开始出现尾巴无力、后肢无力和瘫痪等中枢神经系统疾病症状，之后疾病呈现渐进性的发展，发病率达到100%，见图2。综合上述结果选取感染14 d为实验观察时间。

图1 回归热疏螺旋体感染S组小鼠血液中螺旋体数和特异性抗体发生情况

图2 回归热疏螺旋体感染S组小鼠中枢神经系统症状发生情况

2.2 回归热疏螺旋体感染E组和IL-17-/-组小鼠血液中螺旋体数和特异性抗体发生情况

用回归热疏螺旋体DAH菌株感染E组和IL-17-/-组小鼠后发现，E组和IL-17-/-组小鼠体内的菌血症变化水平基本一致，见图3A。此外，回归热疏螺旋体均能诱导E组和IL-17-/-组小鼠螺旋体特异性IgG和IgM产生，见图3B。

图3 回归热疏螺旋体感染E组和IL-17-/-组小鼠血液中螺旋体数和特异性抗体发生情况

2.3 回归热疏螺旋体感染E组和IL-17-/-组小鼠中枢神经系统症状评分比较

感染9-14 d，IL-17-/-组感染回归热疏螺旋体后的中枢神经系统疾病评分低于E组，差异有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01），见图4。此外，IL-17-/-组小鼠脊髓组织中小胶质细胞的数量少于E组小鼠，见图5。

图4 回归热疏螺旋体感染E组和IL-17-/-组小鼠中枢神经系统症状评分比较

图5 回归热疏螺旋体感染引起E组和IL-17-/-组小鼠组织内的炎性浸润情况（HE染色）

3 讨论

回归热疏螺旋体感染能引起包括中枢神经系统疾病在内的多系统疾病[1]。在前期研究中已发现回归热疏螺旋体感染免疫正常的小鼠诱导的中枢神经系统疾病症状与T淋巴细胞有关[5]，被激活的T淋巴细胞可能通过分泌多种炎性细胞因子参与致病过程[21-22]。

本研究发现，尽管回归热疏螺旋体在IL-17-/-小鼠与C57BL/6野生型小鼠体内均能有效复制，但是与野生型小鼠比较，IL-17-/-小鼠的炎症和神经症状显著减轻，提示IL-17信号通路在RFNB中具有重要作用。最近研究发现[23-25]，IL-17信号通路的激活可能与m-TOR信号通路有关，需进一步探索RFNB中m-TOR信号通路和IL-17信号通路激活的联系，这对于阐明回归热疏螺旋体感染导致的中枢神经系统疾病的致病机制至关重要。