巨噬细胞表达基因在中耳胆脂瘤病理过程中的作用

方练，陈霖，林碧

温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015；1.耳鼻咽喉科；2.病理科

中耳胆脂瘤是颞骨内角质化细胞异常增生性病变，是上皮细胞强烈增殖、角蛋白碎屑大量堆积形成的上皮样囊袋[1-2]，胆脂瘤侵袭性生长可破坏周围骨质，导致各种颅内外并发症，如迷路炎、周围性面瘫和脑脓肿等[3-4]。胆脂瘤中的免疫细胞释放炎症递质，导致咽鼓管功能障碍和中耳黏膜纤毛清除功能减退，中耳细菌产物堆积，造成感染的恶性循环。胆脂瘤的异常增殖可能与过度炎症有关，其具体分子机制目前尚不明确。

巨噬细胞是机体免疫的关键组成部分，能够辨认共生抗原，清除病原体和代谢物，维持组织稳态，如果这一过程被破坏，将产生过度的免疫反应，促进组织炎症的发生和发展，可能导致上皮增殖失控和胆脂瘤生成[5]。

不同部位的巨噬细胞具有转录和功能差异，并由其基因表达谱所决定[6]。本研究通过RNA-Seq方法[7]检测中耳胆脂瘤巨噬细胞的基因表达谱，筛选出差异表达基因，探讨其在中耳胆脂瘤中的生物学功能及信号通路。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年1月至12月温州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科行乳突切除术的慢性化脓性中耳炎患者共57例，经手术探查及HE染色病理检查，其中12例为中耳胆脂瘤，45例为非胆脂瘤型中耳炎。术中分别收集中耳胆脂瘤患者的胆脂瘤基质周围组织和非胆脂瘤型中耳炎患者的中耳肉芽组织。随机抽取3例中耳胆脂瘤标本为试验组，3例非胆脂瘤型中耳炎标本为对照组。

1.2 方法

1.2.1 组织巨噬细胞分离：将收集的标本组织切成小块，在37 ℃ Hank’s液中孵化30 min。用细胞滤网采取吸液和机械分离的方式得到单细胞悬液。用抗人CD14免疫磁珠抗体（购自美国BD公司） 标记巨噬细胞，置于BD IMag的磁场中，CD14+细胞因向磁体迁移而得以分离，重复分离2次后用流式细胞仪检测CD14+细胞的百分比。

1.2.2 总RNA提取、文库构建：用Hank’s液调整细胞悬液浓度至105～106/mL，使用总RNA提取试剂盒（购自南京诺维赞生物科技有限公司）从每个样本中提取总RNA，使用RNA-Seq文库制备试剂盒（购自南京诺维赞生物科技有限公司），用磁珠捕获并片段化mRNA，随机引物合成cDNA第一链，修复cDNA末端，将Illumina接头连接到cDNA，选取cDNA 200～300 bp片段进行PCR扩增，PCR循环数在12～17次之间，获得大约2 μg的PCR产物，用DNA清洁珠纯化PCR产物，于-70 ℃冰箱保存。

1.2.3 测序分析：通过Illumina平台对cDNA进行测序，每个样本获得平均5 000万个150 bp片段的原始数据。对原始数据进行过滤和质量检查，转换成有效读段，映射到人类参考基因组，组装转录本并计算基因读数。对读数进行标准化，以每千碱基对百万片段（FPKM）代表基因表达水平[8]。

1.3 结果分析

1.3.1 全基因组差异表达分析：基于FPKM的差异倍数对数值（log2FC），比较两组间基因的表达水平，P＜0.05被筛选为差异基因。用Pheatmap软件绘制基因表达热图，按基因表达量排序，对差异表达基因进行基因本体论（gene ontology，GO）分析，按分子功能、细胞成分和生物学过程分为三个层次。利用cluster Profiler软件对差异表达基因的信号通路进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析[9]。按基因表达量排序，生成一个矩阵，用基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）方法对两组基因进行全面比较[10]。再通过Cytoscape软件[11]绘制GO相互作用网络图[12]，可视化GSEA结果，去除冗余信息，获得清晰结果。

1.3.2 RT-PCR和qPCR验证：采用RT-PCR法对差异表达量靠前的5个基因进行验证，总RNA分离、cDNA第一链合成和q PCR（荧光定量试剂盒购自日本Takara 公司）的实验步骤按产品说明书进行。在PCR仪上进行35次循环，采用2ΔΔCt计算法，标准化数值，GAPDH为引物的参考基因[13]。

2 结果

2.1 热图分析 根据热图显示，在表达量大于1 FPKM的5 342个基因中，124个基因显示表达明显上调（P＜0.05）。表达上调排前的基因包括肌蛋白（musculin，MSC）、IgA受体Fc片段（Fc fragment of IgA receptor，FCAR）、受体A5样白细胞免疫球蛋白（leukocyte immunoglobulin like receptor A5，LILRA5）和基质金属蛋白酶7（matrix metalloperptidase 7，MMP-7）等，见图1。此外，有66个基因显示表达明显下调（P＜0.05，见图2）。

2.2 功能分析 为了研究差异基因是否参与中耳胆脂瘤的发病过程，对表达上调基因进行GO功能注释，将它们分为41组（P＜0.01，见表1、图3）。通过GSEA和GO相互作用分析，发现差异基因的功能主要集中于B细胞和T细胞免疫、中性粒细胞功能和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulatory protein kinases，ERK）信号的负调控等。

图1 热图显示中耳胆脂瘤巨噬细胞内124个表达上调基因

图2 热图显示中耳胆脂瘤巨噬细胞内66个表达下调基因

表1 排名前十的表达上调基因及其GO分组和生物学功能

表达上调基因FCAR位于8个GO组，主要与中性粒细胞激活、脱颗粒、FCAR介导免疫和三级颗粒等功能有关。白细胞免疫球蛋白样受体位于4个GO组，与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）的生成有关。基质金属蛋白酶（MMPs）如MMP-7、MMP-9和MMP-12基因表达明显上调，参与了降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白的生物学过程。

66个表达下调基因位于54个GO组，主要影响核糖体功能、线粒体ATP合成和呼吸链复合体装配，见表2、图4。

图3 GO功能分析显示所有表达上调基因分布在41个GO组

表2 排名前十的表达下调基因及其GO分组和生物学功能

2.3 信号通路分析 为了明确差异基因对细胞功能的影响，对表达上调基因进行了KEGG信号通路分析，发现上述基因主要信号通路富集于与感染和炎症有关的信号通路，包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染，TNF、溶酶体和趋化因子的信号通路，它们代表着炎症信号级联反应以及对病原体的吞噬 作用。

3 讨论

在中耳炎症时，先天免疫系统检测到病原体相关的分子模式（PAMPS）和损伤相关分子模式（DAMPS），激活炎症相关信号通路，促进血液循环中的中性粒细胞募集至中耳炎症部位。浸润的中性粒细胞分泌一些趋化因子招募炎症单核细胞至炎症部位[14]，这些单核细胞会加速转变成巨噬细胞，其主要生物学功能是慢性感染和免疫应答[15]，可能在中耳胆脂瘤的发生发展中发挥着重要作用，因此，筛选与巨噬细胞生物学功能相关的关键基因和分子通路对于阐明中耳胆脂瘤的发病机制十分重要。

图4 GO功能分析显示所有表达下调基因分布于54个GO组

本研究通过对中耳胆脂瘤巨噬细胞的RNA测序，筛选出124个表达上调基因， 结合GO功能分析，发现表达上调基因主要位于B细胞和T细胞免疫、中性粒细胞活化等组，提示中耳胆脂瘤巨噬细胞通过差异基因主要调控中耳炎症和免疫程度。例如，肌凝蛋白是一个基本的螺旋-环-螺旋转录因子基因，也被称为活化的B细胞因子-1，能调节抗原依赖的B细胞分化[16]和促进外周Treg细胞单向发育[17]，这些免疫细胞能分泌或诱导角质细胞产生多种炎症递质，与炎症细胞浸润数量和感染严重程度密切相 关[18]。另外，FCAR属于免疫球蛋白超家族成员，其膜外区由206个氨基酸组成，与IgA结合，使IgA免疫复合物在髓系细胞中触发信号级联反应，产生多种细胞效应，如内吞作用、吞噬作用、抗体依赖或细胞介导的细胞毒性和刺激细胞因子释放，尤其在黏膜表面的抗感染免疫中发挥重要作用。通过KEGG信号通路分析，发现这些上调基因参与的溶酶体、致病性大肠杆菌感染、金黄色葡萄球菌感染、TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、B细胞受体等信号通路，能放大中耳的促炎反应，趋化其他免疫细胞参与反应，增强中耳炎症过程，许多炎症细胞因子如TNF、IL-8、IL-1α等在增强胆脂瘤细胞增殖能力和激活破骨细胞方面起重要作用[19]，这说明巨噬细胞介导的慢性细菌感染和信号级联放大可能与中耳胆脂瘤上皮细胞异常增殖和骨质破坏有关。

中耳胆脂瘤由囊内容物、基质、基质外层三部分构成，基质包括形成囊壁结构的角化的鳞状上皮，巨噬细胞表达上调基因（如角蛋白-13、MMPs）直接参与调控胆脂瘤角化鳞状上皮增殖和基质重构。角蛋白-13是上皮细胞中间丝细胞骨架的主要成分，具有维持皮肤最外层上皮细胞完整性和正常功能的作用，直接参与细胞的分裂、分化及凋亡等过程[20]。本研究显示角蛋白-13在中耳胆脂瘤基质中表达上调，提示角质形成细胞处于低分化状态，具有较高的增殖和迁移能力，影响原上皮和组织结构的稳态，导致角蛋白碎屑和代谢物堆积。以往对角蛋白的研究还表明，它们与TNF-α、IL-1β等信号转导之间存在着功能联系，参与激活破骨细胞，可能是胆脂瘤侵袭骨质的原因之一[21]。还有研究发现随着胆脂瘤分期的进展，角蛋白-13在外耳道基底上层的表达会逐渐增强，说明角蛋白-13与中耳胆脂瘤的病理过程密切相关[22]。MMPs是一种锌钙依赖的肽链内切酶，在生理情况下表达水平极低，而在炎症因子和氧化应激等情况下表达显著上调。它通过降解ECM和促进ECM重构[23]，影响角质上皮细胞的增殖、迁移和分化[24]。研究发现，中耳胆脂瘤的侵袭能力与MMP-13表达平均光密度显著相关，MMP-13能降解骨基质内的胶原引起骨质破坏，说明其在中耳胆脂瘤骨破坏中发挥重要作用[25]。MMP-7的作用底物更为广泛，包括ECM底物，如IV型胶原、明胶、纤连蛋白，以及具有特殊生物学活性的各种分子，如β4-整合素、E-钙黏蛋白、TNFα前体，MMP-7通过激活这些底物，破坏细胞完整性和相互连接，导致基质重构和上皮迁移，本研究证实MMP-7在中耳胆脂瘤中高表达，可能与中耳胆脂瘤上皮增殖、骨质破坏等有关。

综上所述，本研究筛选出中耳胆脂瘤巨噬细胞的差异表达基因，这些基因富集于炎症和免疫反应相关信号通路；角蛋白-13、MMPs是影响细胞增殖和骨质破坏的关键基因，在中耳胆脂瘤的发生发展中可能起着重要作用。