幼年和成年猪松质骨脱细胞基质有机成分和成骨诱导能力的比较

郭蕊，宋楠，潘昊，林贤丰，金可可

1.温州医科大学 基础医学院，浙江 温州 325035；2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院 浙江省骨骼肌肉退变与再生修复转化研究重点实验室，浙江 杭州 310000

大面积骨缺损再生是一个漫长的修复过程，而且面临不能完全修复的风险。自体骨移植是骨缺损修复的金标准，但会造成供体部位骨量下降、感染和长期疼痛等并发症[1]。生物材料骨移植是一种有前景的替代治疗方法。理想的骨移植材料要有生物相容性、可降解性和低免疫原性的特点，还要有促进细胞迁移和血管长入的作用。天然松质骨脱细胞基质（cancellous bone decellular matrix，DCBM）具有疏松多孔的结构，含有丰富的I型胶原（collagen I，Col-I）和骨基质中的生长因子，对骨缺损部位的修复填充、血管长入和成骨细胞募集迁移具有明显的调控作用[2]。不同年龄段干骺端松质骨组织在骨小梁排列、胶原分布和生长因子含量等方面存在差异，因此在促进骨修复方面也有不同的特点。本研究选取幼龄和成年的猪股骨干骺端松质骨，用本课题组自主设计[2]的脱细胞方案去除细胞保留细胞外基质，采用纳米液相色谱-串联质谱（LCMS/MS）分析两种DCBM的蛋白组成，比较幼年和成年猪DCBM的促骨生长细胞因子和诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）成骨分化能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 DCBM的制备：按本课题组的优化配方用相同方案制备幼年（3月龄）和成年（6月龄）DCBM，去细胞效果符合以下标准：①HE和DAPI染色无核残留；②DNA残留量小于50 ng/mg干重；③残留DNA片段小于200 bp[3]。实验分AN组（成年天然松质 骨）、AD组（成年脱细胞松质骨）、YN组（幼年天然松质骨）和YD组（幼年脱细胞松质骨）。

1.1.2 主要试剂：Masson染色试剂盒和阿利新蓝染色试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。羟脯氨酸检测试剂盒购自南京凯金生物科技有限公司。Blyscans GAGs测定试剂盒购自英国Carrick Fergus公司。Anti-Col-IA2 antibod y（ab270994）、Anti-BMP2 antibody（ab214821）、Anti-osteocalcin antibody（ab93876）、MMP-13 polyclonal antibody（ab52915）购自英国Abcam公司。兔SP免疫组化试剂盒（SP-9001）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。q PCR SYBR Green Master Mix试剂盒购自上海元升生物科技公司。细胞计数试剂盒8（CCK-8试剂盒，目录号GK10001）购自美国GLPBIO公司。C57/B6小鼠MSC购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.3 主要器材：Scientific Easy-nano LC II纳流液相色谱仪、LTQ Orbitrap XLTM组合式质谱仪、热电Multiskan FC酶标仪（Thermo，美国），荧光定量PCR仪Lightcycler480（Roche，瑞士），ParK NX10原子力显微镜（PARK，韩国）。

1.2 方法

1.2.1 胶原蛋白含量分析：使用羟脯氨酸（Hyp）测定试剂盒分析胶原蛋白含量。将4组骨粒分别称重（每组n=5），按照说明书步骤，将所测吸光度代入标准曲线计算得Hyp含量，并基于Hyp与胶原蛋白的比率计算胶原蛋白水平，量化为μg/g湿重。用Masson三色染色评估胶原分布情况。

1.2.2 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAGs）含量分析：将4组样品（每组n=5）冻干至恒重，按照说明书步骤，将所测吸光度代入标准曲线计算每个样品的GAGs含量，量化为μg/mg干重。用阿利新蓝染色评估GAG在骨小梁中的分布。

1.2.3 免疫组化检测基质生长因子：将4组组织样本切片脱蜡后用枸橼酸钠抗原修复液进行抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，PBS缓冲液清洗3次。滴加10%山羊血清室温封闭1 h，将切片分别与抗骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、抗基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase，MMP-13）、抗骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、抗Col-I以1:200（v/v）的稀释度4 ℃孵育过夜，PBS洗涤5 min×3，滴加二抗，室温孵育1 h，PBS洗涤5 min×3，DAB显色后苏木素复染核。于光学显微镜下镜检拍照。

1.2.4 原子力显微镜分析表面微观结构：利用冰冻切片机将AD、YD组松质骨材料（每组n=5）切10 μm 的薄片，吸附于石英玻片上，并浸于75%乙醇中去除冰冻切片包埋剂。将干燥的组织薄片置于原子力显微镜观察台上，校准精度后，探针以500 nN和1 Hz的频率敲击材料表面，随机选取5处面积为5 μm× 5 μm的材料表面区域获得表面形貌和3D图，利用Nanoscope Anaysis 1.9分析表面粗糙度。

1.2.5 浸提液检测DCBM的细胞毒性：使用CCK-8试剂盒评估脱细胞骨组织的细胞毒性。制备2 mg/mL浸提液于37 ℃孵育24 h，收集浸提液并用0.22 μm滤网过滤。将MSC以2 000个/孔铺板到96孔板中，孵育24 h后，用200 μL各种浓度（0%、25%、50%和100%）的浸提液置换孔内的培养基。培养1、3、5和7 d后，将10 μL CCK-8溶液添加到平板的每个孔中，37 ℃温育1 h后，测量450 nm处的吸光度。

1.2.6 细胞复植与q PCR检测成骨诱导性能：①细胞复植：将AD组和YD组用完全培养基冲洗3次，无菌纱布吸干多余培养液。按1×106个细胞/DCBM基质复植MSC，静置于37 ℃培养箱1 h。然后将含细胞的DCBM支架移板于24孔板中，添加培养液培养。获取复植细胞1、2、3周后的材料用于后续实验。② qPCR：将收集的复植细胞的DCBM材料在液氮中充分碾磨成粉末后，纯化提取RNA。用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，用SYBR Green法添加引物于cDNA中，用q PCR分析仪检测各基因的Ct值。以GAPDH作为内参，利用2-△△Ct值评估OCN、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Col-I、BMP-2基因表达量以评估细胞成骨分化情况。

1.2.7 LC-MS/MS分析DCBM蛋白组成：LC-MS/MS分别测定AD组和YD组的肽序列（每组n=3）。首先，将样品在4% SDS和100 mmol/L DTT溶液中匀浆，参考酶切制备程序（FASP）进行蛋白水解[4]。随后将肽溶液收集，脱盐并纯化。纯化的蛋白在Easy nano液相色谱仪上进行分析。用0.1%甲酸洗涤浓缩肽溶液在反相捕集柱上，用梯度浓度的乙腈从分析柱上洗脱。立即在LTQ Orbitrap X质谱仪分析洗脱的肽。将两组所得蛋白LFQ intensity均值用geneontology. org/网站经“生物过程”“细胞成分”和“分子功能”通道进行基因本体论分析，并对AD组和YD组所特有的蛋白质序列分析进行富集分析。

图1 脱细胞对DCBM有机成分的影响

1.3 统计学处理方法 采用Graphpad Prism 8.0进行统计学分析。数据以 ±s表示，2组比较采用双尾非配对t检验，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞外基质重要有机成分的保留情况 阿利新蓝染色和GAGs定量结果表明，相比于成年松质骨组织，幼年松质骨组织在脱细胞前后GAGs含量高，且去细胞对含量影响较小；免疫组化分析显示，脱细胞过程对Col-I含量影响较小；Masson三色染色显示，脱细胞后幼年和成年松质骨骨小梁的完整性和连续性得到很好保留，且幼年松质骨存在更多的蓝染未成熟胶原；Col-I免疫组化染色显示幼年松质骨脱细胞后胶原暴露更充分。见图1。

2.2 DCBM细胞因子的保留情况 免疫组化染色显示，与AN组相比，YN组含有较多的BMP-2、MMP-13、OCN，而且脱细胞后YD组较AD组有更丰富的细胞因子保留在基质中（见图2）。

2.3 松质骨的细胞黏附与成骨诱导性能 CCK-8细胞活性检测结果显示，培养1、3、5、7 d对照组（0%浸提液组）和其他各组（25%、50%、100%浸提液组）细胞代谢活性均无明显下降（P＞0.05），见图3。MSC种植后1周固定切片做HE染色，YD组黏附更多细胞；AFM原子力显微镜显示，AD组微观表面多突起且不平整，起伏较小（±68.8 nm），幼猪脱细胞松质骨微观表面平整且有较大的起伏（±221.6 nm），见图4。AD组和YD组粗糙度的统计量分别为11.935± 3.76，34.18±2.57（P=0.0001）。细胞种植培养1、2、4周后，以单层培养细胞为参照，YD组均可更强地诱导早期（ALP）及晚期(OCN)成骨标志物，显示出更好的早期成骨诱导性能（见图5）。

图2 DCBM细胞因子的保留情况（标尺均为200 μm）

2.4 脱细胞松质骨蛋白质谱差异 利用LC-MS/MS技术对脱细胞松质骨进行全谱蛋白鉴定，AD组共鉴定出65种有意义的功能蛋白，YD组鉴定出290种有意义的功能蛋白。通过基因本体论GO富集分析，生物过程通道显示YD组在骨化、细胞外基质组成、骨矿化和生物矿化的-log FDR值（肽段相对含量）和蛋白含量占比（%）均高于AD组（见图6A）。细胞成分通道显示YD组在细胞外区域、细胞外基质、含胶原细胞外基质和各种纤维胶原多聚体的-log FDR值和含量也高于AD组（见图6B）。在分子功能通道，虽然YD组在细胞外基质结构组成、胶原连接和细胞外基质结构组成功能肽段的-logFDR值高于AD组，但是蛋白成分占比显著低于AD组（见图6C）。此外，从蛋白质谱结果可得，除两组相同的蛋白外，YD组会残留较多的生长因子在松质骨基质中，比如成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）、转化生长因子（transforming grow th factor， TGF）、胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）等，而AD组蛋白质谱未检测到相关肽段（见图6D）。

图3 细胞增殖CCK-8实验结果

图4 MSC复植HE切片染色和AFM原子力显微镜扫描AD和YD表面形貌和粗糙度

图5 诱导不同时间点qPCR检测成骨指标

3 讨论

骨缺损再生漫长且易发生畸形，延迟愈合和畸形愈合会对患者造成身心负担和对医师制定治疗方案造成挑战[5-6]。自体骨移植易造成供体部位缺损和感染风险，导致病程延长[7]。骨移植物的基本特性是骨传导、骨诱导、成骨特性和结构支撑，理想的移植物还应满足生物安全、体内可降解性、力学性质稳定的特点[8]。

图6 脱细胞松质骨的蛋白质组学比较分析

猪和人的基因序列有极高的相似度，天然来源的猪器官脱细胞的细胞外基质及其制备的水凝胶已批准用于临床，如心脏、肌腱、血管、皮肤等[9]。猪来源的脱细胞松质骨作为异种来源的天然生物材料已在临床前研究中有所实践[10]。成年猪骨已经发育完全，其基质中保留的Col-I以及骨基质中沉积的成骨生长因子也随年龄的增长而下降。生长期的猪松质骨的特征是有机质含量高，骨髓中含有丰富的成骨细胞，能产生大量的细胞因子沉积骨基质中。本研究选取幼年猪松质骨（3月龄）制备细胞外基质，3月龄猪股骨干骺端发育完整，有利于远离骨骺板的松质骨取材。优化调整配方使得幼年和成年猪骨在相同条件下完全去除细胞以及核成分。

骨组织细胞外基质有机成分主要为Col-I（占90%），其他非胶原蛋白有GAGs和沉积于基质中的成骨生长因子。GAGs带有负电荷和有很强的吸水性，有助于保护生长因子和保持骨陷窝内细胞的内环境稳态，促进移植部位细胞的增殖、分化和黏附[11]。BMP-2是重要的成骨和成血管诱导因素，可以通过VEGF通路诱导局部血管生成[12]。rhBMP-2是唯一获美国FDA批准的BMP，在腰椎椎体的修复中使用并取得良好的临床效果[13]。MMP-13在骨骼生长和骨折重塑中起关键作用[14]。OCN占骨总蛋白的1%～2%，与羟基磷灰石和钙有很强的结合性，具有钙离子转运和抑制羟基磷灰石膨胀的作用[15-16]。TGF-β1是骨骼组织中高度丰富的生长因子，可刺激成骨细胞中MMP-13 的表达，在骨折和骨缺损过程中重塑骨骼，同时残留在细胞外基质中的游离MMP-13可在骨修复过程中重塑改建的胶原，使胶原避免过度增加形成骨痂，有利于骨骼恢复原始结构功能[17-18]。在蛋白质谱分析中，由于SDS和Triton-X100等阴离子去污剂的作用，使得成年猪脱细胞松质骨中相应细胞因子蛋白肽段低于检出限，成年猪松质骨未检测出FGF、TGF、IGF等相关肽段，而生长期骨组织中会沉积大量的促细胞生长因子，相同条件下会保留更多的生长因子于骨基质中，在移植部位发挥更好的骨诱导性作用。

细胞从基质上分离会在细胞外基质的表面形貌、粗糙度等超微结构形成不同的变化。移植材料的表面粗糙度可以调节缺损部位趋化募集的破骨细胞分化为不同的表型，对成骨细胞的成骨分化有不同的诱导作用[19]。表面粗糙度较高的细胞外基质上会沉积更多的钙和矿物质，诱导干细胞向成骨表型分化[20]。材料表面粗糙度会对材料的黏附性产生影响，粗糙度越高，接触面的比表面积越大，骨科常用的金属植入物均有改变粗糙度以增加人体适应性的研究[21]。本研究发现幼年松质骨脱细胞后有更粗糙的表面，在实验中种植细胞培养显示幼年松质骨会在表面黏附更多的细胞。

本研究最后用生物信息学对两种松质骨的差异蛋白进行GO富集分析，生物过程通道的富集分析显示幼年猪DCBM在细胞外基质组成、骨矿化过程和生物矿化等含有更高丰度的相关蛋白，体现其生长期骨重塑过程中胶原改建和钙沉积的过程。细胞成分通道的富集分析显示幼年松质骨的细胞外基质组成、含胶原细胞外基质结构和各种纤维胶原多聚体结构相关蛋白的表达显著高于成年松质骨，体现成骨细胞活跃沉积细胞外基质的结果。分子功能通道的分析显示，细胞外基质结构组成、胶原连接和细胞外基质结构组成功能肽段丰度成年松质骨更占优势，体现了成年松质骨维持正常生理功能的过程。

综上，本研究从细胞因子、材料超微结构和分子蛋白组成等方面分析了幼年和成年DCBM的差异，结果显示幼年脱细胞松质骨在细胞黏附和诱导成骨方面优于成年松质骨，是优良的骨移植替代物。