香烟烟雾提取物抑制小鼠骨骼肌细胞再生的机制研究*

郑桂贤，李 超，邓招惠，谢 婷，霍增榆，韦鑫燕，白 晶

（广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，南宁 530021）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的以持续气流受限为特征的慢性肺部疾病。肌少症（sarcopenia）是COPD 常见的合并症，表现为骨骼肌质量和力量的下降，伴随着躯体残疾、生活质量下降和死亡的风险。COPD 合并肌少症患者疾病预后差，病死率高[1]。骨骼肌质量的维持与骨骼肌细胞代谢、骨骼肌干细胞（卫星细胞）肌再生能力有关[2-3]。COPD合并肌少症的研究，集中在骨骼肌细胞代谢与骨骼肌萎缩、衰老方向[3]，对骨骼肌卫星细胞的研究甚少。研究显示，卫星细胞数量、活性等下降是导致骨骼肌丢失的重要原因[4]。烟草烟雾调控小鼠骨骼肌卫星细胞再生能力的相关机制尚未见研究报道。小鼠C2C12 成肌细胞是来源于骨骼肌前体细胞的肌源细胞，使用2%马血清培养6 d可将细胞诱导分化为成熟的骨骼肌细胞[5]，被广泛用于肌肉再生的体外模型研究。本实验以小鼠C2C12 成肌细胞为研究对象，诱导细胞分化6 d构建骨骼肌再生模型，研究香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）对C2C12 成肌细胞肌再生能力的影响，同时观察分化过程中CSE对C2C12成肌细胞分化能力、衰老的影响，探讨CSE 抑制小鼠骨骼肌细胞再生的机制，为COPD合并肌少症的发病机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 小鼠C2C12 成肌细胞购于中科院上海细胞库。胎牛血清、马血清、DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶、青－链霉素双抗（Gibico 公司）；香烟（Marlboro 公司）；荧光定量扩增试剂盒（TAKARA 公司）；RNA 逆转录试剂盒（Promega 公司）；MyHC、MyoD、Myogenin 鼠单克隆抗体（Santa Cruz 公司）；P53、P21、P16 兔单克隆抗体（Abcam）；β-actin兔单克隆抗体（武汉三鹰公司）；山羊抗兔荧光二抗（CST）。

1.2 CSE 的制备[5]连接驱动装置上的注射器，去掉滤嘴，将两支香烟固定于注射器的一端，慢慢抽吸注射器数次后，震荡以使烟雾均匀溶于2 mL PBS中，制成CSE 悬液，经0.22 μm 滤膜过滤除菌，将CSE溶液稀释至所需浓度用于后续实验。

1.3 C2C12 成肌细胞培养及实验分组[5]在5%CO2、37 ℃的培养箱中培养细胞，用含10%胎牛血清的高糖培养基培养增殖期的C2C12 成肌细胞，消化，离心，计数，接种相同细胞数的C2C12成肌细胞于培养皿中，待其铺满80%左右，更换成含2%马血清的培养基诱导细胞分化。从分化开始的第1天加入CSE 进行干预，每隔2 d 换液一次，分化6 d 后即可形成骨骼肌细胞。收集分化3 d 和分化6 d 的细胞用于后续实验。将未加入CSE 干预的细胞设为正常（N）组，加入CSE干预的细胞为CSE组。

1.4 细胞免疫荧光法鉴定骨骼肌细胞 将C2C12成肌细胞接种于24 孔板中，用2%马血清诱导分化培养6d 后，用PBS 浸洗孔板细胞3 次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS 浸洗3 次，3 min/次；0.5%Triton X-100(PBS 配制)室温通透20 min；PBS浸洗3次，3 min/次；滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸掉封闭液，不洗，MyHC 一抗（1∶200）置于4 ℃冰箱孵育过夜。第2 天，PBS 浸洗孔板3 次，3 min/次，滴加荧光二抗（1∶5 000），37 ℃孵育1 h，PBS 浸洗3 次，3 min/次；滴加DAPI 避光孵育5 min，对孔底细胞进行染核，PBS洗4次，5 min/次，洗去多余的DAPI；然后在荧光显微镜下观察采集图像。MyHC表达阳性（胞质被染成红色）表明该细胞是骨骼肌细胞，即C2C12成肌细胞成功分化为骨骼肌细胞。

1.5 Western blotting 法检测MyHC、MyoD、Myogenin、P53、P21、P16 蛋白表达 收集培养皿的细胞，4 ℃离心，去掉上清后加入蛋白裂解液，30 min后再次离心吸取上清，BCA 法检测蛋白浓度；SDSPAGE分离蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜，一抗孵育过夜（P53、P21、P16抗体的稀释比为1∶1 000，MyHC、MyoD、Myogenin 抗体的稀释比为1∶500）；洗膜，荧光二抗(1∶10 000)常温孵育1 h，使用Odyssey红外扫膜仪（LICOR公司）直接扫膜成像，显示蛋白条带。

1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA 相对表达量 收集两组细胞，提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，用荧光定量扩增试剂为上机（ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪）扩增做准备。MyHC4上游引物（上海生工生物工程有限公司合成）：5’-CAGACAGAGAGGAGCAGGAGAGTG-3’，下游引物：5’-TTGGTGTTGATGAGGCTGGTGTTC-3’；MyHC7 上游引物：5’-CAGAACACCAGCCTCATCAACCAG-3’，下游引物：5’-TTCTCCTCTGCGTTCCTACACTCC-3’。首先激活酶活性（95 ℃，10 min），然后按照变性（95 ℃，15 s）、退火和延伸（60 ℃，60 s）程序，共40 个循环。用2-△△Ct法计算MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件分析实验数据，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨骼肌再生模型的鉴定 显微镜下可见处于增殖期的C2C12 成肌细胞呈单核、梭形（图1A），诱导分化6 d 后，细胞融合形成含多个细胞核的肌管（图1B），且经骨骼肌细胞标志物MyHC 抗体孵育后，细胞质被染成红色（图1C），表示C2C12 成肌细胞成功分化为骨骼肌细胞。

2.2 两组MyHC mRNA 及蛋白表达比较 诱导分化6 d 后，与N 组比较，CSE 组MyHC 蛋白水平降低，MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA 表达水平显著下降（均P＜0.05），见图2。

图1 不同时期的C2C12成肌细胞形态及MyHC免疫荧光图

图2 两组骨骼肌细胞MyHC蛋白表达及MyHC4 mRNA、MyHC7 mRNA表达比较

2.2 两组细胞分化指标MyoD、Myogenin蛋白表达比较 诱导分化3 d 后，与N 组比较，CSE 组细胞中MyoD、Myogenin 蛋白表达水平明显降低（均P＜0.05），见图3。

图3 两组MyoD、Myogenin蛋白表达比较

2.3 两组细胞衰老指标P53、P21、P16表达比较 诱导分化3d后，与N组比较，CSE 组细胞中P53、P21、P16蛋白表达水平显著升高（均P＜0.05），见图4。

图4 两组P53、P21、P16蛋白表达比较

3 讨论

机体内静息状态的卫星细胞具有骨骼肌再生能力，在应对外界因素（衰老、炎症等）中为骨骼肌提供肌核和肌纤维，对损伤修复和维持肌肉完整性有着决定性的作用[6-7]。最新的研究发现，烟草烟雾暴露的小鼠和COPD合并肌少症患者骨骼肌组织中静息状态的卫星细胞减少[8]，卫星细胞早衰及再生潜能耗尽可能是骨骼肌功能受损的原因[9]。本研究目的是通过体外复制CSE诱导下骨骼肌再生模型，探讨CSE 对C2C12 成肌细胞分化成骨骼肌细胞中再生机制影响。

C2C12 成肌细胞具有自我增殖、定向分化为骨骼肌细胞能力，是体外研究肌肉再生的最佳模型。成肌细胞分化能力是骨骼肌细胞形成的关键，由肌源性调节因子（MRFs）的MyoD 家族调控分化步骤[10]。Myogenin 是MRFs 的一员，作用于MyoD 的下游，在推动成肌细胞分化的终末阶段发挥这重要的作用[10-11]。本研究结果显示，C2C12成肌细胞经诱导分化后变成肌管，分化后细胞的细胞质被染成红色，含多核，表明这些细胞是成熟的骨骼肌细胞，提示本研究使用的体外骨骼肌细胞再生模型是成功的。CSE 暴露下，细胞MyHC 荧光强度明显减弱；MyHC蛋白表达水平，I型骨骼肌纤维MyHC7、II型骨骼肌纤维MyHC4的mRNA水平显著下降（均P＜0.05）。这些结果提示，CSE抑制C2C12成肌细胞再生能力，同时表现为I型骨骼肌纤维MyHC7、II型骨骼肌纤维MyHC4 表达减少，提示骨骼肌细胞的耐力、肌力明显减弱。同时，进一步的研究结果显示，CSE干预下，成肌细胞分化指标MyoD、Myogenin表达水平明显降低（均P＜0.05），这提示CSE 抑制C2C12成肌细胞的分化能力。Sancho-Munoz等[8]研究发现，COPD患者骨骼肌卫星细胞数量减少，股外侧肌MyoD、Myogenin 表达降低。在合并肌少症的COPD患者的股外侧肌检测到静息状态的卫星细胞减少，激活的卫星细胞增多；严重的COPD患者无论是否并发肌少症，激活的卫星细胞增多，触发肌细胞再生过程。因此，结合本研究结果，可推测在COPD 患者中尽管观察到激活的卫星细胞增多，然而激活的卫星细胞可能并未能分化成骨骼肌细胞，从而导致骨骼肌质量并未得到维持而是丢失。烟草烟雾调控骨骼肌再生能力值得进一步深入研究，为COPD合并肌少症的治疗及预防提供新的策略和参考。

研究认为，衰老与卫星细胞再生能力密切相关[12-13]。P53 与骨骼肌衰老、卫星细胞功能有关[14]。有研究证明，P53直接调控MyoD依赖性转录途径，抑制Myogenin表达，调节成肌细胞分化[11]。最新的研究发现，P53 在调节卫星细胞分化和自我更新的平衡中发挥重要作用，这项研究指出P53 必须在成肌细胞退出细胞周期时快速返回到基础水平，以便细胞发生分化；在未分化的成肌细胞中，p53水平持续增加抑制肌分化和促进细胞自我更新[15]。MyoD的激活诱导P21表达促进成肌细胞进入终末分化阶段。相反，P21 诱导和MyoD 激活失偶联抑制终末分化[16]。此外，静息状态的卫星细胞可由于P16 表达升高诱导细胞衰老，无法被激活而失去肌再生潜力[4]。研究发现，在肢体废用诱导的骨骼肌萎缩模型中P53、P21 蛋白表达水平升高[17]，烟草烟雾暴露激活小鼠膈肌P53/P21 途径，可能与膈肌萎缩相关[18]。由此可知，烟草烟雾抑制骨骼肌再生障碍的机制可能与细胞衰老有关。本研究结果发现，CSE暴露下，衰老因子P53、P21、P16 蛋白水平显著增高（均P＜0.05），提示CSE 诱导细胞分化能力下降的同时伴有细胞衰老水平增加。CSE诱导P53蛋白水平升高，这与MyoD、Myogenin 蛋白水平降低的结果一致。同时，CSE也诱导P21蛋白水平升高，促进细胞退出细胞周期，但MyoD 蛋白表达下降，提示CSE 诱导C2C12 成肌细胞退出细胞周期但并未能成功进入分化时期。从这个角度理解可以解释COPD 合并肌少症患者骨骼肌激活卫星细胞增多，但骨骼肌再生能力减弱这一现象。此外，P16 蛋白水平增高可能是CSE 诱导C2C12 成肌细胞衰老失去定向分化能力的机制，这也从另一个角度说明，CSE诱导P53水平增加可促进细胞自我更新而肌再生能力降低这一看似矛盾的结果，可能是由于这些新生的成肌细胞失去分化能力。

综上所述，香烟烟雾暴露下C2C12成肌细胞再生能力受到抑制，可能与CSE诱导细胞分化能力减弱、P53/P21信号途径激活诱导细胞衰老有关。