小鼠肝细胞的原代和传代培养的研究

2021-05-24李维维

学校教育研究 2021年7期

一、实验原理

细胞培养是用无菌操作的方法，将动物体内的组织取出，模拟体内的生理条件，在体外进行培养。培养过程分为原代培养和传代培养。原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞，组织和器官，用无菌操作的方法，经销化，分散成为单个游离的细胞。在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。传代培养是指细胞自从一个培养瓶以1：2比例转移，接种到另一培养瓶的培养。

这次实验我所用的抗生素瓶和小玻璃珠便用于细胞的传代培养。本来这次实验用小玻璃珠，这种模式融汇了扩大贴壁面积和便于观察的优点，并且重演性好。

二、材料

（一）实验动物

乳鼠10只，体质量7～8g，刚出生三天，保持室温20℃～25℃;

（二）实验器材

空的抗生素瓶玻璃珠眼科剪眼科镊试管吸管等

（三）实验试剂

磷酸缓冲液（PBS）;平衡盐液：Hank原液 Hank液;细胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA钠盐液。以上溶液经包装，灭菌后备用

三、实验步骤

（一）试剂的配制

1.Hank原液与Hank液的配制

配制程序：

（1）称取1.4g Hank原液，溶于30～50ml的蒸馏水中。

（2）取1000ml烧杯及容量瓶各一个，先放蒸馏水800ml于烧杯中，然后逐一称取药品，但必须在前一药品溶解后，方可加入下一药品，充分混匀后，分装，盖紧瓶盖，写好标签，置于4°C冰箱保存。

2.胰蛋白溶液的配制

3.0.02%的EDTA鈉盐溶液的配制

4.水解乳蛋白—Hank液的配制

5.E-MEM营养液的配制

6.104U/ml青霉素、链霉素的配制

（二）实验营养液的配制

1.原代细胞营养液的配制

2.传代细胞营养液的配制

（三）培养器皿

1.玻璃漏斗式滤器

玻璃漏斗式滤器将滤板与玻璃漏斗烧结成一体，适用于各种培养用液的过滤除菌，但不宜血清等粘稠液体。

2.手术器械

主要用于解剖动物，取材和原代培养中切割组织。各种器械至少需配置两套

3.培养瓶

用于原代培养的需要卡氏瓶10～15瓶，而传代培养需用12～25个卡氏瓶，另准备5瓶抗生素瓶，每次用完后，清洗时一定要彻底，以防下次用时污染。

4.其他器皿

无论是烧杯量筒还是锥形瓶等，每种至少要准备四个以上，用于配药，装废液等

（四）肝细胞的培养过程

1.原代细胞的培养过程

（1）操作者首先进行手的清洗与消毒，在实验台上放置一个酒精灯，并用酒精擦拭实验台，将小鼠放置实验台上，解剖前用酒精棉擦拭鼠体。

（2）取材

①用镊子将乳鼠的脊柱夹短

②用解剖刀切开腹部，找寻乳鼠肝脏，为三瓣、半个手指大小

③用弯头眼科镊取出肝脏，置于注有Hank液的小烧杯中

（3）剪碎

用眼科剪将肝脏剪碎，尽量细致地剪，大约1mm2大小的块，大小尽量均匀一致，然后用Hank液洗涤2～3次，直到液体澄清为止。

（4）消化及分散组织块

将上步清洗的Hank液吸掉，加入0.25%胰蛋白液。置于37°C水浴中进行消化，消化时间在20～30min左右。每隔十分钟摇动一次小烧杯（其中最好放几粒玻璃珠），以便组织块散开，以便继续消化，直到组织块变成松散、粘稠状，并且，颜色略微变为白色为止。放在离心机中离心，吸去上清液，用吸管反复吹打组织块，直到散成混淆的细胞悬液为止。

（5）计数及稀释

从上步的细胞悬液中吸取1ml细胞液，进行计数。将细胞液滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释。

（6）分装及培养

将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般为5ml/卡氏瓶），盖上瓶盖，切勿太紧，以免不透气。在培养瓶上做好标签，注明细胞，及日期，然后置于37oC，5%浓度CO2的CO2培养箱中进行培养。

（7）观察：每日进行观察

四、结果与分析

（一）结果

原代第一次实验

总结：这次接种后细胞的贴壁生长原代培养宣告失败，失败的原因有以下几种可能：

①培养液配制的浓度不够，导致培养液失效

②接种浓度不够，因为一只乳鼠共接种了30瓶，之后又没有计数，很可能是浓度不够

③胰蛋白酶的活性弱