基于UPLC-Q-TOF MS技术快速鉴定蒸制广佛手化学成分

吴学峰，谢 斌，黄晓兰，吴惠勤，霍延平，周 熙

(1.广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006；2.广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)， 广东省分析测试技术公共实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070)

广佛手为芸香科柑橘属植物佛手CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle的干燥果实，其味辛、苦、酸、性温；归肝、脾、肺经，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰等功效，用于肝胃气滞所致的胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐、咳嗽多痰等症状[1]。广佛手作为我国传统名贵南药，主产于广东高要、德庆等地，于2016年被收录为《广东省岭南中药材保护条例》第一批受保护的8种岭南中药材之一，其特色不仅体现在产地方面，更体现在饮片炮制加工。在岭南地区，尤其是在广东地区的临床上，实际应用的佛手多为蒸制广佛手[2]。作为岭南特色中药饮片，其与生品功效相似，炮制后辛燥性更低[3]。目前，佛手的化学成分组成[4-6]、药理作用[7-9]、含量测定[10-12]及指纹图谱[13-15]等研究主要集中在佛手生品上，而对制佛手的研究较少。汪金玉等[2,16]利用GC-MS技术研究广佛手蒸制前后挥发性成分的差异，并建立了同时适用生、制佛手的HPLC指纹图谱；罗朵生等[17]对生、制佛手挥发油成分含量进行分析，发现佛手炮制后挥发油中不饱和化合物减少、饱和化合物增多；李勇等[18-19]研究了不同炮制方法对佛手多糖与黄酮含量的影响，发现以水为溶剂时总多糖提取率高，炮制前后总多糖含量无明显变化；黎珊等[20]发现蒸制时间对主要成分及抗氧化活性有显著影响，蒸制2.5 h的佛手抗氧化能力最强。以上研究报道均没有揭示蒸制广佛手的化学成分。中药经炮制后化学成分往往会发生变化，继而表现出不同的性味和药效[21]。分析鉴定蒸制广佛手化学成分，对揭示其炮制内涵和质量控制有重要意义。

本工作拟建立超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF MS)鉴定蒸制广佛手的化学成分，为揭示佛手岭南特色炮制方法的科学性、制定蒸制广佛手质量控制指标、研究蒸制广佛手药理作用等提供数据支持。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

1290液相色谱-G6540系列四极杆-飞行时间质谱联用仪：美国Agilent公司产品，配有ESI电喷雾离子源，紫外检测器，MassHunter数据采集系统；TP-114型电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司产品；KQ2200型超声波清洗器：东莞市科桥超声波设备有限公司产品；H1850R离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品。

1.2 材料与试剂

蒸制广佛手药材(批号YPA8A001)：购自广东杏园春药店，按照1984年版《广东省中药炮制规范》除去杂质或喷水后蒸2～3 h，取出、晒干，经广州中医药大学中药学院潘超美教授鉴定为芸香科植物佛手CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle的干燥果实制品。

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司产品；蒸馏水：中国香港屈臣氏公司产品；甲酸：色谱纯，美国Fisher Scientific公司产品；乙酸铵：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品。

5，7-二甲基香豆素、佛手苷内酯、香叶木苷、香叶木素、诺米林、黄柏酮、6,7-二甲氧基香豆素、棕榈酸、原儿茶酸、圣草次苷、佛手酚，对照品：成都瑞芬思生物科技有限公司产品；水合羟基前胡素：上海诗丹德生物技术有限公司产品；阿魏酸、柠檬苦素、橙皮苷、芦丁、欧前胡素：广州分析测试中心科力技术开发公司产品；壬二酸：成都格雷西亚化学技术有限公司产品；蔗糖：广州化学试剂厂产品；苹果酸：常州新华活性研究所产品；所有对照品纯度均大于98%。

1.3 实验方法

1.3.1供试品溶液制备 将蒸制广佛手药材粉碎后过3号筛(50目，孔径0.355 mm)，称取约1.0 g样品于50 mL锥形瓶中，加入10 mL无水甲醇，摇匀，超声1 h，静置10 min后取上层清液，移入离心管，以14 000 r/min离心10 min，取上清液，即为供试品溶液。

1.3.2对照品溶液制备 分别精密称取适量的各对照品于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解(蔗糖加少量水溶解后，用甲醇稀释)并定容至10 mL容量瓶中，制成单一对照品储备液。临用前取适量的各对照品储备液并混合，用甲醇稀释至各对照品浓度约为1 mg/L，即为混合对照品溶液。

1.3.3色谱条件 Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(3.0 mm×150 mm×2.7 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～2 min(95%A)，2～18 min(95%～80%A)，18～30 min(80%～65%A)，30～40 min(65%～55%A)，40～50 min(55%～20%A)，50～54 min(20%～2%A)，54～56 min(2%A)，56～56.1 min(2%～95%A)，56.1～60 min(95%A)；流速0.35 mL/min；正离子模式进样量4 μL，负离子模式进样量6 μL；柱温30 ℃；紫外检测器：双波长模式；信号A、B的波长分别为254、280 nm，检测时间60 min。

1.3.4质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)在正、负离子模式下采集数据，毛细管电压分别为4 000、3 500 V；喷嘴电压1 000 V；毛细管出口电压150 V；锥孔电压65 V；干燥气温度300 ℃；干燥气流速8 L/min；鞘气温度350 ℃；鞘气流速12 L/min；碰撞能量梯度10、20、40 eV，一级质谱扫描范围m/z100～1 000。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的优化

根据文献[4-5]对佛手提取的研究，本实验分别考察了70%、80%、90%、100%甲醇与乙醇作为提取液的效果。上机测定后，经MassHunter Qualitative Analysis B.07.00软件处理分析数据。结果表明，甲醇提取液样品较乙醇的成分丰富，色谱峰响应更强、峰形更好，且100%甲醇提取液中的化学成分数量较其他比例甲醇提取液多。综合以上，选择100%甲醇为提取溶剂。

2.2 色谱条件优化

实验对比了Poroshell 120 PFP(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)(A)、Poroshell 120 SB-C18(3.0 mm×150 mm×2.7 μm)(B)、Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm×2.7 μm)(C)3种不同型号的色谱柱，以出峰个数、峰形、峰面积、分离度和基线等指标综合评价。结果表明，采用C柱得到的色谱图基线平稳、峰形较好；A柱得到的谱图基线不平稳；相同条件下B柱对黄酮的分离度较其他色谱柱差。实验还比较了0.1%甲酸水-甲醇溶液(A)、0.1%甲酸水-乙腈溶液(B)、0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈溶液(C)3种流动相体系。结果表明，流动相C体系下，黄酮、香豆素、有机酸等物质均有较好的响应，色谱峰峰形良好。综上，最佳色谱柱为Poroshell 120 EC-C18柱，流动相为0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸铵水-乙腈溶液。

2.3 数据处理方法

本实验整理了文献[4-5,22-29]中芸香科柑橘属植物的成分，按照名称、化学式、CAS号、特征碎片离子等信息，建立了芸香科柑橘属类植物的化学成分数据库(命名为：ZGFS-DATA)。

利用MassHunter Qualitative Analysis B.07.00软件处理蒸制广佛手提取液总离子流图中检测出的各色谱峰。在一级质谱图中，根据各色谱峰的精确质量数、同位素丰度比和误差范围(≤5×10-6)确定分子式。在二级质谱图中，获得特定保留时间范围的指定分子离子的二级质谱碎片信息，结合各数据库推测每个峰的化学结构。具体方法如下：将实验采集的原始数据导入Qualitative Analysis B.07.00数据分析软件，通过菜单选项中的“方法编辑器”，在子菜单“正离子”、“负离子”中分别勾选“+H、+Na、+NH4”与“-H、+HCOO、+CH3COO”；在“数据库/谱库”中导入自建数据库“ZGFS-DATA”，运行“按分子式查找化合物”即可完成按精确质量数筛选出的化合物分子式，再结合二级质谱图的碎片离子信息推测化学结构、对照品验证，综合Scifinder数据库(https:∥scifinder.cas.org)、MassBank数据库(http:∥www.massbank.jp)及安捷伦中药化合物数据库进行化学成分的分析鉴定。

2.4 鉴定结果

对蒸制广佛手药材成分进行分析，其总离子流图示于图1。可见，在正离子模式下，主要检测到香豆素类、生物碱类成分，以[M+H]+多见；在负离子模式下，峰信息较丰富，黄酮及黄酮苷类、有机酸、酯类成分为主要的检测类别，检测离子以[M-H]-、[M+COOH]-为主；在总离子流图的前端，主要为极性较大的糖苷类和有机酸类物质。

利用Qualitative Analysis B.07.00分析软件匹配分子式，利用各数据库、文献报道以及对照品进一步验证，排除假阳性结果。共鉴定出67个化学成分，包括22个香豆素、12个黄酮及黄酮苷类、15个有机酸、6个糖苷类、5个柠檬苦素以及7个其他成分，其中有24个化学成分为首次在佛手中检出，分别为奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、原儿茶酸、蔗糖、儿茶酚、七叶内酯、木犀草素-6，8-葡萄糖苷、4-羟基苯甲醛、圣草次苷、金圣草素-6，8-葡萄糖苷、香叶木素-6-葡萄糖苷、对羟基肉桂酸、莨菪亭及其异构体、壬二酸、异嗪皮啶及其异构体、去乙酰闹米林酸、闹米林酸、独活素、蓖麻酸、(E,E)-9-酮-10,12-十八碳二烯酸，详细情况列于附表1(请登录《质谱学报》官网http：∥www.jcmss.com.cn下载)。其中香豆素类化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎等活性[30]；有机酸类化合物，如原儿茶酸可用于消炎抗菌[31]，苹果酸有抗氧化能力[32]；黄酮及黄酮苷类有很好的抗氧化、抗菌及抗肿瘤活性[33]；脱乙酰诺米林酸、闹米林酸等柠檬苦素类成分具有抗癌和抗病毒作用[34]。

图1 正(a)、负(b)离子模式下，蒸制广佛手的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of processed citrus medica L. var. sarcodactylis swingle at positive (a) and negative (b) ion modes

2.5 蒸制广佛手中各类成分的鉴定

2.5.1黄酮类成分鉴定 从蒸制广佛手中共鉴定出12个黄酮类化学成分，其中橙皮苷、香叶木苷、圣草次苷、香叶木素、芦丁通过与对照品比对得以确证。黄酮包括黄酮苷元类化合物和黄酮苷类化合物。黄酮苷元类化合物的质谱裂解特征主要为丢失CO、COO、CH3基团，或丢失H2O等中性分子及发生逆-狄尔斯-阿德尔反应(RDA)裂解形成一系列特征离子峰；黄酮苷类化合物主要通过连续丢失糖基形成丰度较高的黄酮苷元[5]。如成分20，保留时间为19.646 min，正离子模式下准分子离子为m/z597.179 6[M+H]+，分子式C17H32O15，在二级质谱中有2种可能的裂解方式：1) 先丢失C6H10O4形成m/z451.112 5[M+H-C6H10O4]+碎片离子，再丢失C6H10O5形成m/z289.070 3[M+H-C6H10O4-C6H10O5]+碎片离子；2) 先丢失C6H10O5形成m/z435.128 1[M+H-C6H10O5]+碎片离子，再连续丢失2个H2O分子形成m/z417.117 5[M+H-C6H10O5-H2O]+、m/z399.106 3[M+H-C6H10O5-2H2O]+碎片离子。根据化学成分的二级质谱裂解特征，经Scifinder、MassBank及Agilent PCDL等数据库与相关文献[25]的支持，推测该成分为圣草次苷。该化合物首次在佛手中检出，属于黄酮类，具有抑制氧化应激、炎症反应等活性[35]，其二级质谱图及可能的质谱裂解途径示于图2。

2.5.2香豆素类成分鉴定 本实验从蒸制广佛手中共鉴定了22个香豆素类化学成分，其中6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷内酯、水合羟基前胡素、佛手酚、欧前胡素、葡萄内酯等与对照品比对得到确证。香豆素类化合物有相同的母核，在二级裂解过程中，其裂解特征主要为丢失 CO、CH3等基团。以成分18为例，其保留时间为19.027 min，正离子模式下准分子离子为m/z193.049 1[M+H]+，预测分子式为C10H8O4。在二级质谱中，可先后丢失CO、CH3形成m/z150.031 2[M+H-CH3-CO]+碎片离子，再经重排后丢失CO形成m/z122.036 5[M+H-CH3-CO-CO]+碎片离子；或者直接丢失1分子CH3OH形成m/z161.023 1[M+H-CH3OH]+碎片离子，再连续丢失2个CO基团分别形成碎片离子m/z133.028 6[M+H-CH3OH-CO]+、m/z105.033 6[M+H-CH3OH-CO-CO]+。根据化学成分的二级质谱裂解特征，经数据库检索及文献确认[6]，该成分为莨菪亭，为首次在佛手中检出，属香豆素类成分，有祛暑功效[36]，其二级质谱图及可能的质谱裂解途径示于图3。

2.5.3有机酸类成分鉴定 本实验从蒸制广佛手中共鉴定出15个有机酸类化学成分，其中原儿茶酸、壬二酸、苹果酸、棕榈酸、阿魏酸等与对照品比对得到确证。有机酸类化合物二级质谱中主要丢失H2O、HCOOH等中性分子或COO基团。成分5的保留时间为7.576 min，在负离子模式下得到准分子离子m/z153.019 6[M-H]-，预测分子式为C7H6O4。由二级质谱可见，其失去1分子COO基团形成m/z109.030 0[M-H-COO]-碎片离子，或者失去羧基形成m/z108.020 0[M-H-COOH]-碎片离子。经过数据库检索、文献[22]及对照品比对，推断该成分为原儿茶酸。原儿茶酸具有抗血小板凝集、抑菌、镇痛等药理活性，近年来研究发现其具有抗氧化、抗癌及预防神经退行性疾病等药理作用[37]，二级质谱图及质谱裂解途径示于图4。

图2 圣草次苷二级质谱图(a)及其可能的裂解途径(b)Fig.2 MS/MS spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of eriocitrin

图3 莨菪亭二级质谱图(a)及其可能的质谱裂解途径(b)Fig.3 MS/MS spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of scopoletin

图4 原儿茶酸二级质谱图(a)及其可能的质谱裂解途径(b)Fig.4 MS/MS spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of protocatechuic acid

2.5.4糖苷类成分鉴定 本实验从蒸制广佛手中共鉴定出6个糖苷类化学成分。由于糖基的存在，糖苷类物质主要以脱去己糖或戊糖产生特征碎片离子为主。二级质谱中主要有[M-H-162]-(脱己糖)、[M-H-150]-(脱戊糖)及糖环开裂产生的[M-H-120]-、[M-H-90]-等特征离子。以成分24为例，其保留时间为21.195 min，在负离子模式下得到准分子离子m/z397.114[M-H]-，预测分子式为C18H22O10。

二级质谱中失去1分子C6H10O5形成m/z235.061 6[M-H-C6H10O5]-碎片离子，再失去1分子CO2形成m/z191.071 8[M-H-C6H10O5-CO2]-碎片离子，最后再失去1分子CH3形成m/z176.048 1[M-H-C6H10O5-CO2-CH3]-碎片离子。经过数据库检索与文献比对[5]，推测该化合物为6-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸，其二级质谱及可能的质谱裂解途径示于图5。

图5 6-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸二级质谱图(a)及可能的质谱裂解途径(b)Fig.5 MS/MS spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of cnidioside B

3 结论

本研究基于UPLC-Q-TOF MS技术结合各数据库，分析鉴定了蒸制广佛手中化学成分，共鉴定出67个化学成分，包括12个黄酮及黄酮苷，22个香豆素，15个有机酸，6个糖苷类，5个柠檬苦素，7个其他成分，其中有24个成分为首次在佛手中检出，同时，研究了各类成分的质谱裂解机理，黄酮和香豆素具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抗高血压等药理活性[38]，这两类物质可能是蒸制广佛手发挥药效的物质基础。本研究阐明了蒸制广佛手的化学物质基础，为进一步明确药效物质基础和质量控制提供了科学依据。

致谢：感谢安捷伦中药化合物数据库提供的数据支持。