添食辛硫磷对家蚕不同组织碱性磷酸酶活性的影响

杨伟克，唐芬芬，杨 海

(1.云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2.红河学院 生命科学与技术学院，云南 蒙自 661101)

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP，EC 3.1.3.1)是一类高度保守的磷酸水解酶，直接参与生物体磷酸基团的转移和代谢过程[1]。ALP主要分布在昆虫的肠道、血淋巴、脂肪体和唾液腺等部位，它不仅参与机体的能量代谢、生长发育、激素合成等过程，而且在昆虫机体的解毒代谢和免疫防御过程也发挥着重要功能[2]。ALP对于家蚕机体生理代谢的稳定性极其重要，其活性大小与蚕体的生理状态及抗病性密切相关[3-4]。通常情况下，ALP活性越高，蚕体抗性越强，其幼虫生长发育健康齐一，茧丝产量和质量在一定程度上均有所提高[5]。

家蚕来源于野桑蚕，由于长期人为的驯化，其对野外环境、气候及农药等的适应性相对较弱。有机磷农药是桑园常用的一类杀虫剂，它在一定程度上能有效防治桑园害虫，但对以桑叶为唯一食物来源的家蚕也会造成一定的毒害作用[6]。昆虫在遭受有机磷农药胁迫时，机体正常生理代谢平衡被打破，解毒酶、抗氧化酶以及各种水解酶等一系列酶均会发生不同程度的变化[7-8]。ALP被认为是一类与昆虫抗性密切相关的水解酶，它不仅参与昆虫抵御病原微生物的侵染过程，而且在杀虫剂的解毒代谢过程中发挥了重要作用[9]。高建华等[10]用BmNPV感染家蚕幼虫，发现ALP活性及其编码基因的表达量在感染中期增加，在感染后期会急剧减弱，表明ALP参与了家蚕抗BmNPV的免疫防御过程。家蚕遭受苏云金芽孢杆菌或黑胸败血芽孢杆菌感染后，机体ALP活性呈现先逐渐增强后急剧减弱的的变化趋势[11-12]。孙毅等[13]用家蚕病原微孢子虫N.b和SCM6交叉感染四龄家蚕，中肠ALP活性呈现先迅速升高随后急剧降低的趋势。用HearNPV侵染棉铃虫幼虫，能够显著抑制ALP的活性，且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关。ALP活性的下降与病毒下调其编码基因ALP的表达水平有关[14]。用低剂量的螟硫磷处理云杉色卷蛾，其血淋巴和中肠ALP基因被显著上调，编码的碱性磷酸酶活性也显著高于对照组[15]。氟对家蚕中肠和血淋巴ALP活性有明显的抑制作用，该抑制作用会随着氟浓度的增加而增强，中肠ALP活性降低会导致家蚕幼虫体质量显著降低[16]。

辛硫磷作为一种高效低毒的有机磷杀虫剂，具有广谱性和高效性，被广泛应用于桑园害虫的防治[17]。乙酰胆碱酯酶、细胞色素P450氧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶和酯酶等参与家蚕有机磷农药和杀虫剂代谢的研究已有大量报道[18-20]，而关于ALP在家蚕代谢有机磷农药过程中的生理作用及分子机制的研究鲜见报道。以家蚕ALP为靶标，研究喂食辛硫磷后家蚕不同组织ALP活性变化规律，明确ALP在家蚕对辛硫磷代谢过程中发挥的功能和作用，旨在为解析家蚕等鳞翅目昆虫对有机磷农药的解毒代谢机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试家蚕品种为大造，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所资源研究室保存和饲育。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 Thermo Fisher双光束紫外/可见分光光度计和ThermoFisher高速冷冻离心机购自昆明伯腾仪器有限公司，HSW24型电热恒温水浴锅和IMS-40雪花制冰机购自广州深华生物技术有限公司。

1.2.2 主要试剂 辛硫磷购自江苏宝灵化工股份有限公司，丙酮、对硝基苯磷酸二钠、巴比妥钠盐酸缓冲液和氢氧化钠等试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 添毒方法 将辛硫磷原药溶于丙酮配制成100 g/L的原液，再用水稀释成1 g/L的工作液，用微量移液器经口喂食五龄第3天家蚕幼虫，每头家蚕喂食3 μL。以喂食等量的无菌水为对照组。取喂食后3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h和24 h家蚕的血淋巴、脂肪体、中肠和丝腺，对照组同时取材。每次取样均设4次重复，每个重复取5头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。

1.3.2 酶液制备 分别取0.3 g的中肠、丝腺和脂肪体迅速放入玻璃匀浆器中，加入500 μL预冷的巴比妥钠盐酸缓冲液(0.04 mol/L，pH值9.7)，在冰上充分研磨匀浆，随后将匀浆液倒入1.5 mL无菌离心管中，在4 ℃条件下，以3 500 r/min的转速离心25 min，取上清液转移至新的1.5 mL无菌离心管中，即为待测酶液。取250 μL家蚕血淋巴，加入350 μL预冷的巴比妥钠盐酸缓冲液(0.04 mol/L，pH值9.7)，直接在4 ℃条件下，以4 000 r/min的转速离心20 min，弃沉淀取上清液，即为待测酶液。

1.3.3 酶活性测定 酶活性测定主要参照何华伟等[4]的方法。在1.5 mL无菌离心管中先加入0.04 mol/L的巴比妥钠盐酸缓冲液400 μL和7.5 mmol/L的对硝基苯磷酸二钠100 μL，随后加入待测酶液100 μL。置于37 ℃水浴30 min，取出后再加入0.1 mol/L的NaOH溶液400 μL终止反应，室温放置10 min。用紫外分光光度计测定其在405 nm处的吸光值，据对硝基酚标准曲线逐一求出每个单独处理的酶活性，最后计算不同处理组的平均值。

1.4 数据处理

利用Excel 2016和SPSS 21.0对数据进行处理和作图。

2 结果与分析

2.1 辛硫磷对家蚕脂肪体ALP活性的影响

由图1可知，在3～12 h，喂食辛硫磷处理组与对照组家蚕脂肪体ALP活性无显著变化，在喂食辛硫磷15 h和18 h，ALP活性极显著高于对照组(P<0.01)，而在21 h 酶活性开始急剧下降并显著低于对照组(P<0.05)，并且在24 h极显著低于对照组(P<0.01)。

2.2 辛硫磷对家蚕血淋巴ALP活性的影响

如图2所示，在喂食辛硫磷后12 h，血淋巴的ALP活性开始增加，并且显著高于对照组(P<0.05)；在15 h和18 h酶活性持续高于对照组，分别是对照组的2.2和2.4倍，差异达到极显著水平(P<0.01)；而在21 h酶活性开始急剧降低，其酶活性大小是对照组的60%，在24 h酶活性降至对照组的20%，差异达到极显著水平(P<0.01)。

2.3 辛硫磷对家蚕中肠ALP活性的影响

由图3可以看出，中肠ALP活性在喂食辛硫磷后3 h，与对照组相比没有显著差异，但从6 h开始ALP活性显著增加(P<0.05)，在9 h、12 h和15 h酶活性均极显著高于对照组(P<0.01)，但在喂食辛硫磷18 h后，ALP活性开始显著下降(P<0.05)，并且在21 h和24 h极显著低于对照组(P<0.01)。在测定的时间范围内，喂食辛硫磷后家蚕中肠ALP活性整体呈现先增加后减弱的变化趋势。

图2 喂食辛硫磷后家蚕血淋巴ALP活性变化Fig.2 Changes of ALP activity in hemolymph of silkworm after feeding phoxim

图3 喂食辛硫磷后家蚕中肠ALP活性变化Fig.3 Changes of ALP activity in midgut of silkworm after feeding phoxim

2.4 辛硫磷对家蚕丝腺ALP活性的影响

图4结果显示，喂食辛硫磷后，家蚕丝腺ALP活性逐渐被抑制，随着时间的延长，酶活性急剧减弱。在喂食辛硫磷3 h和6 h，丝腺的ALP活性都是略低于对照组，但差异未达到显著水平；在9 h至24 h酶活性持续低于对照组，其中在9 h和12 h酶活性分别下降至对照组的76%和70%，差异达到显著水平(P<0.05)；而在15 h、18 h、21 h和24 h，ALP活性分别降低至对照组的57%、48%、39%和13%，且差异均达到极显著水平(P<0.01)。

图4 喂食辛硫磷后家蚕丝腺ALP活性变化Fig.4 Changes of ALP activity in silk gland of silkworm after feeding phoxim

3 结论与讨论

ALP是昆虫体内调控磷酸代谢的关键酶，在外源化合物和杀虫剂的解毒代谢过程发挥了重要作用。低浓度的螟硫磷能显著提高云杉色卷蛾幼虫ALP活性[15]。赤拟谷盗进食含有菊酯类杀虫剂的饲料后，中肠和脂肪体ALP基因表达量增加，其编码的碱性磷酸酶活性显著上升[21]。对除虫菊酯类杀虫剂具有抗性的棉铃虫品系，其ALP活性显著高于敏感品系[22]。唐芬芬等[23]的研究表明，外源蜕皮激素20E 和保幼激素JH均能诱导家蚕血淋巴和中肠ALP基因的表达，显著增强ALP活性，暗示ALP在家蚕蜕皮变态过程发挥了一定的作用。本研究结果显示，添食辛硫磷后，ALP活性在家蚕不同组织的变化规律并不一致。不同组织ALP对辛硫磷的响应时间存在一定的差异。在测定的时间范围内，经口喂食辛硫磷，其最先接触和刺激肠道，随后进入脂肪体和血淋巴，最后才会影响丝腺。所以，中肠组织ALP活性在喂食辛硫磷6 h开始逐渐增加，在15 h达到最高值，随后急剧减弱，在24 h极显著低于对照组。而血淋巴和脂肪体ALP活性分别是从12 h和15 h开始增加，并且在18 h酶活性均较高，在21 h和24 h酶活性被抑制，显著低于对照组。而辛硫磷对丝腺ALP活性具有显著的抑制作用，并随着时间的延长，酶活性急剧减弱。

喂食辛硫磷后，家蚕中肠、脂肪体和血淋巴ALP活性整体呈现先增加后减弱的变化趋势，而丝腺ALP活性从9 h开始一直处于被抑制的状态。辛硫磷经口进入蚕体，或多或少都会对机体造成一定的毒害作用，此时脂肪体、中肠和血淋巴等组织通过分泌或激活相关防御因子及各类水解酶和解毒酶，用于维持蚕体正常的生命代谢活动，但随着机体各组织遭受辛硫磷毒害程度的加深，蚕体正常生理代谢系统严重紊乱，众多水解酶和解毒酶的活性被抑制。ALP与蚕体磷酸物质的转移、消化、吸收及茧丝蛋白的合成密切相关。丝腺是家蚕的泌丝器官，而五龄是家蚕丝腺细胞生长发育的关键时期，此时蚕体接触到辛硫磷等有机磷农药，丝腺细胞受损，其合成的ALP活性降低，丝物质的分泌量减少，影响茧丝的产量。推测辛硫磷处理后，丝腺ALP活性显著降低，可能是家蚕有机磷农药慢性中毒后不吐丝营茧的重要原因。

综上，用低剂量的辛硫磷处理家蚕，不同组织器官ALP活性变化规律及其对辛硫磷的响应时间及受影响程度并不一致。经口添食辛硫磷后，家蚕脂肪体、血淋巴和中肠ALP活性呈现先显著升高后急剧降低的变化趋势，而丝腺组织ALP活性从9 h开始显著降低，并一直处于被抑制状态。提示中肠、脂肪体和血淋巴ALP在家蚕代谢辛硫磷过程中发挥了重要作用，而丝腺ALP并不参与这个过程。本研究添食辛硫磷的剂量相对较低，ALP活性测定也仅仅局限在处理后的24 h内。在设定的测定时间范围内，蚕体并未出现明显病变及异常生理状况。今后，要明确ALP活性对家蚕吐丝营茧以及茧丝产量和质量的影响，有必要对辛硫磷的剂量和处理时间进行更深入细致的探索和研究。