CYP24A1基因多态性与中国汉族女性乳腺癌关系的病例对照研究及meta分析

贺宝霞，陈金花，宋文凭，张文周

(郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院 药学部，河南 郑州 450008)

维生素D水平与乳腺癌发生发展的关系备受关注[1-2]。1α，25-二羟维生素D3[1α，25-dihydroxyvitamin D3，1α，25(OH)2D3]具有较强的抗肿瘤作用，不仅能抑制肿瘤细胞增殖，还能诱导细胞分化与凋亡。研究发现，细胞色素P450 24A1(cytochrome P450 24A1，CYP24A1)是体内活性维生素D进行生物转化的关键酶[3]。CYP24A1基因为候选致癌基因[4]。研究表明，CYP24A1基因多态性可以被作为判断非小细胞肺癌预后的指标之一[5-6]。CYP24A1基因表达水平也可能成为评估肺腺癌和直肠癌预后的指标[7-8]。CYP24A1存在基因多态性，并且这些多态性可能影响大肠癌的发生和预后[9]。本研究探讨CYP24A1rs6068816(C>T)多态性与中国汉族女性乳腺癌易感性的关系，并通过meta分析评价rs6068816(C>T)多态性与乳腺癌的关系，旨在为有关中国汉族女性乳腺癌易感性的病因学研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 病例对照分析

1.1.1一般资料 收集2012年1月至2016年12月郑州大学附属肿瘤医院收治的674例中国汉族女性乳腺癌患者(病例组)和健康体检中心672例健康体检者(对照组)的全血标本。本研究经过郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)医学伦理委员会批准后进行。所有受试者知晓研究内容并签署知情同意书。入选病例组的标准：经病理诊断为乳腺癌的中国汉族女性患者。入选对照组的标准：与病例组年龄相匹配的健康女性，经B超和钼靶X线排除乳腺癌。病例组和对照组的排除标准：(1)合并内分泌系统疾病、其他肿瘤、全身代谢疾病或其他严重疾病；(2)从事放射性照射职业；(3)主动或被动吸烟；(4)长期服用外源性雌激素。

1.1.2CYP24A1基因多态性检测

1.1.2.1试剂与仪器 全人血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，北京天根生物公司；MgCl2、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphate，dNTP)和Hotstar Taq酶均购自Qiagen公司(德国)；质谱仪、MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪、Spectrochip芯片、MassARRAY RT软件系统(版本号3.0.0.4)、MassARRAY Typer软件系统(版本号3.4)，均购自Sequenom公司(美国圣地亚哥)；引物由上海英骏生物公司合成。

1.1.2.2检测过程 采用试剂盒提取基因组DNA，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)检测基因分型。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)：反应体系5 μL，包括水1.9 μL，PCR缓冲液0.5 μL(含20 mmol·L-1MgCl2)，25 mmol·L-1MgCl20.4 μL，25 mmol·L-1dNTP 0.1 μL，Hotstar Taq酶0.1 μL，PCR引物1 μL和 DNA样本1 μL；反应程序为94 ℃预变性15 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45个循环，最后72 ℃延伸3 min。碱性磷酸酶去磷酸化：人血清淀粉样蛋白P(serum amyloid P，SAP)缓冲液0.17 μL，SAP酶0.3 μL和ddH2O 1.53 μL；反应程序为37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。单碱基延伸反应：ddH2O 0.62 μL，iPLEX缓冲液0.2 μL，终止混合物0.2 μL，延伸引物0.94 μL，iPLEX酶0.04 μL和PCR纯化产物7 μL；反应程序为94 ℃预变性30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，共40个循环，最后72 ℃延伸3 min。树脂除盐纯化，SpectroCHIP芯片点样。Mass Spectrometry检测，使用Typer 4.0软件分析完成基因分型。

1.1.3统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件处理数据。采用Pearson’sχ2检验进行基因型频率及等位基因频率比较和Hardy-Weinberg平衡分析。P<0.05为差异有统计学意义。

1.2 meta分析

1.2.1文献检索 以“乳腺癌”“基因多态性”“CYP24A1”和“rs6068816”为关键词检索中文数据库包括中国知网、维普和万方数据库；以“breast cancer”“breast carcinoma”“genetic polymorphisms”“gene polymorphism”“CYP24A1”“rs6068816”为检索词检索PubMed、Cochrane Library、EMBASE等外文文献数据库，时间截止至2020年6月30日。

1.2.2文献纳入和排除标准 (1)纳入标准：①有关CYP24A1rs6068816多态性和乳腺癌易感性关系的病例对照研究；②研究样本量明确，有相应基因型的频数分布或优势比(odds ratio，OR)值，或根据提供的数据能够计算出频数分布的文献。(2)排除标准：①非多态性研究的文献；②非rs6068816位点与乳腺癌易感性关系的研究。

1.2.3统计学方法 采用RevMan 5.3软件进行meta分析。采用χ2检验分析纳入文献的异质性。若各研究间不存在异质性(I2≤50%)，采用固定效应模型进行统计分析；若各研究间存在异质性(I2>50%)，采用随机效应模型进行统计分析。利用Begg’s检验绘制漏斗图，根据漏斗图的对称性来检测所纳入文献是否存在发表偏倚。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例对照研究

2.1.1一般资料 两组年龄、体质量指数、绝经率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 病例组和对照组基本情况比较

2.1.2CYP24A1rs6068816多态性与乳腺癌的易感性关系CYP24A1rs6068816 CC、CT和TT基因型在病例组的分布频率分别为40.1%(270/674)、52.5%(354/674)和7.4%(50/674)，在对照组的分布频率分别为 37.5%(252/672)、51.9%(349/672)和10.6%(71/672)。病例组和对照组CYP24A1rs6068816位点基因型分布(CC+CT与TT)比较，差异有统计学意义(χ2=4.074，P=0.046)。

2.2 meta分析

2.2.1文献概况 共收集到相关文献4篇，最终纳入已发表文献2篇[10-11]，合并本研究上述结果后进行meta分析。meta分析中正常对照组3 094例，乳腺癌组2 355例。纳入meta分析文献的一般资料见表2。

表2 纳入meta分析文献的基本特征(n)

2.2.2meta分析结果 已纳入文献不存在异质性(P>0.05)，采用固定效应模型进行分析。T等位基因相对于C等位基因是乳腺癌的保护因素(P<0.05)，见图1。突变纯合型TT与野生纯合型CC比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。显性遗传模型TT与CC+CT基因型比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。已纳入文献不存在发表偏倚。

图1 CYP24A1 rs6068816与乳腺癌易感性的meta分析(T等位基因与C等位基因)

图2 CYP24A1 rs6068816与乳腺癌易感性的meta分析(TT基因型与CC基因型)

图3 CYP24A1 rs6068816与乳腺癌易感性的meta分析(TT基因型与CC+CT基因型)

3 讨论

CYP24A1属于细胞色素P450超家族成员，主要作用是催化25-羟基维生素D3和1，25-二羟基维生素D代谢为24-羟基化产物，导致维生素D失活[3]。CYP24A1在肾脏和胃肠道黏膜表达量较高。CYP24A1抑制剂能够增强1α,25(OH)2D3的抗肿瘤细胞增殖作用。

近年来，多个研究报道CYP24A1遗传多态性与多种肿瘤的易感性关系，如肺癌、乳腺癌以及结直肠癌等[9-12]。有研究表明CYP24A1mRNA的表达水平与乳腺癌有关[13]。在乳腺发育和妊娠相关的乳腺发育中，CYP24A1起关键作用[14]。CYP24A1在多种肿瘤细胞中高表达，可以减弱1，25(OH)2D3的抗肿瘤活性，这可能是CYP24A1影响肿瘤发生的机制之一[15]。Sadeghi等[9]研究发现，CYP24A1rs4809960 CC基因型能够降低结直肠癌的发病风险。CYP24A1rs6068816 T等位基因携带者患肺癌的风险相对较低[16]。CYP24A1rs2762934、CYP24A1rs6068816与肺癌发病风险有较强的相关性[12]。有关CYP24A1rs2585428(G>A)、rs4809960(T>C)、rs6022999(A>G)和rs6068816(C>T)的研究结果显示，ATGC单倍型大肠癌的发病风险显著降低[17]。CYP24A1rs6068816的多态性与中国人群胃癌易感性有关[18]。由本研究结果可知，rs6068816(C>T)突变可能会影响CYP24A1的活性，导致体内活性1，25(OH)2D3水平改变，抗肿瘤作用减弱，进而影响肿瘤的发生。CYP24A1多态性在不同人群中的分布和遗传特征不同。本研究与Reimers等[10]研究结果一致，与Clendenan等[11]研究结果相反。

本研究对rs6068816多态性与乳腺癌的易感性进行了meta分析，结果依然显示rs6068816 TT等位基因为乳腺癌的保护因素。有关rs6068816多态性与乳腺癌的文献较少，meta分析仅纳入检索文献2篇[10-11]及本研究中病例对照分析的数据。仍需扩大样本量并选取多个种族样本进一步证实CYP24A1rs6068816多态性与乳腺癌的易感性关系，并分析rs6068816多态性影响CYP24A1酶活性的机制，为乳腺癌的预防和治疗提供参考依据。