耐钼细菌选育驯化技术研究

程 浩，孟运生，刘 辉，周 磊，师留印，张静敏

(核工业北京化工冶金研究院，北京 101149)

中国火山岩型铀矿石储量较大，约占全国总储量的20%以上，其中相当部分为铀钼矿、铀钼金银矿[1]，开发利用这类铀矿资源具有很强的现实意义。在铀钼共生矿中，铀矿物以沥青铀矿为主；钼矿物以辉钼矿、胶硫钼矿为主。

近年来钼及其化合物的应用领域不断拓宽，钼的需求量不断上升，钼的湿法浸出研究也倍受重视。具有工业价值的钼矿物主要是辉钼矿(MoS2)，它占国内外开采钼量的98%左右。辉钼矿型铀矿属于难浸矿石，常规浸出方法是将矿石破磨到-250 μm(-60目)后，加入氧化剂进行酸浸或高压碱浸，其工艺流程复杂，试剂消耗量大，生产成本高。

近年来微生物湿法冶金技术在加工稀贵金属的硫化物矿石上取得了较大进展，硫化铜矿细菌浸出技术、难处理金矿的细菌氧化预处理技术等在国内外都已产业化[2]，铀矿细菌浸出在国外也已经实现工业化应用[3]。核化冶院经过多年的研究，也于2002年首次实现铀矿细菌堆浸工业化[4]。对于难浸的铀钼共生矿，尚未见细菌浸出方面的研究报道，对于辉钼矿细菌浸出工艺研究也相对较少。

采用细菌浸出工艺处理辉钼矿是依靠细菌的作用，完成对金属硫化矿的氧化，解除硫化矿物对铀、钼等有价金属的包裹，打通基质粒间、微裂隙通道，方便浸出剂的进入和浸出液的渗出，从而提高铀、钼、铜、锌、镍等有价金属的浸出率，提高资源利用率[5]。采用氧化亚铁硫杆菌(T.f)来氧化辉钼矿(MoS2)是可行的[6]；但现有菌种对辉钼矿(MoS2)氧化效率低，对Mo的耐受性能低[7]，从而导致浸出时间长，钼浸出率低。因此进行新菌株耐钼选育的研究，对优化钼矿细菌浸出过程，降低生产成本，提高资源综合回收利用率都具有重要的意义。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

主要仪器：PHS-3B型精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)；生物显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)；真空泵(沈阳市真空泵厂)；微孔滤膜(北京黎明膜分离技术有限责任公司)；WFZUV-2000型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；BS210S型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；OLYMPUS BX51型系统显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；温度梯度PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)；凝胶成像系统(英国Syngene公司)；紫外投射反射分析仪(上海康华生化仪器制造厂)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；三角瓶、烧杯、试管、培养皿(博美玻璃仪器厂)。

主要试剂包括硫酸、硫酸亚铁、氯化钠、琼脂粉、硫酸铵、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁，均为国产分析纯试剂。

1.2 试验菌种

试验菌种包括原氧化亚铁硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌和野生菌LM1。

氧化亚铁硫杆菌为革兰氏阴性无机化能自养菌。该菌好氧嗜酸，以Fe2+和还原态硫为能源物质，可以氧化Fe2+、元素硫及几乎所有的硫化矿物，能有效分解黄铁矿。它以空气中的CO2为碳源，吸收N、P、K等无机营养，合成菌体细胞，在金属硫化矿或煤矿的酸性矿坑水中较为常见。该菌形状呈圆端短柄状，细胞直径约0.5～0.8 μm，长度约1.0～1.5 μm，端生鞭毛，能运动；适宜生长pH为1～4(最佳生长pH为1.8～2.5)，存活温度为2～40 ℃(最佳存活温度为30～35 ℃)。

氧化亚铁钩端螺旋菌(L.f)购于美国标准菌种收藏所(ATCC)，该菌为专性好氧、无机化能自养菌。它以铁和黄铁矿为能源物质，呈螺旋状，细胞直径约0.2～0.4 μm，长度约0.9～1.1 μm，典型革兰氏阴性菌，单鞭毛，可动；适宜生长pH为1.5～4.0(最佳生长pH为1.8～2.5)，存活温度为5～40 ℃(最佳存活温度为28～32 ℃)。

野生菌LM1是从河南栾川钼矿的矿坑水中分离纯化而来。使用富集培养基对该矿坑水样品进行富集培养，将培养得到的野生菌通过涂布法接种到固体培养基中，再从固体培养基产生的单独菌落中挑取细菌接种至液体9K培养基中培养；如此往复进行，通过固液交替培养方法纯化得到菌株LM1。

1.3 培养基配方

液体9K培养基：在1 000 mL蒸馏水中加入3.0 g (NH4)2SO4、0.5 g K2HPO4、0.1 g KCl、1.0 g MgSO4·7H2O、44.4 g FeSO4·7H2O，混合均匀，并在121 ℃下灭菌20 min。液体9K培养基的pH=2.0。

固体培养基：在1 000 mL蒸馏水中加入5.0 g (NH4)2SO4、0.15 g KCl、0.75 g MgSO4·7H2O、2.0 g FeSO4·7H2O、10 g琼脂，混合均匀，并在115 ℃下灭菌30 min。固体培养基的pH=4.6～4.8。

富集培养基：2倍浓度的液体9K培养基。

1.4 细菌耐钼驯化试验方法

细菌浸矿技术中常用的无机化能自养菌的选育技术有驯化育种和遗传选育[8]。驯化育种是在人为逐渐改变外界环境条件的情况下，对细菌进行转移培养，通过细菌本身优胜劣汰的过程演变，使那些活性较强并逐渐发生变异的细菌存活下来，最终培育出适应性、耐受性较强的新菌株[9]。

本研究采用的驯化方法为浓度梯度驯化法，即在菌株转移培养的过程中逐步提高培养基中的钼浓度，筛选出耐受性强的菌株，从而达到对试验菌钼耐受性驯化的目的。

1.4.1 氧化亚铁硫杆菌耐钼驯化

往9K培养基中加入钼酸铵，在pH 1.7～2.2、温度28～35 ℃(用加热棒控制温度)条件下鼓气培养，监测培养物氧化还原电位大于500 mV时，将一半菌液用微孔滤膜(孔径为0.22 μm)过滤。过滤后细菌截留在滤膜上，用蒸馏水将其冲洗入剩余培养基中，补充9K培养基和钼酸铵，提高培养基中的钼浓度，继续驯化培养。不断重复上述操作，逐步提高细菌对钼的耐受能力。

1.4.2L.f菌和野生菌耐钼驯化

在500 mL的三角瓶中加入9K培养基再加入钼酸铵，控制ρ(Mo)由低到高逐渐增加进行驯化培养，首先在ρ(Mo)为100 mg/L的9K培养基中接种20%(体积分数)的菌种，在生物培养箱中鼓气培养(30 ℃，150 r/min)；当培养基中的电位大于500 mV时，作为新的菌种再接种到ρ(Mo)更高的9K培养基中，再次驯化培养，接种量一般为培养基体积的10%。这样依次不断增加ρ(Mo)进行耐钼驯化。

2 驯化试验结果与讨论

2.1 氧化亚铁硫杆菌驯化结果

经过一年驯化，氧化亚铁硫杆菌耐钼浓度达到550 mg/L；次年继续对其进行驯化，试验结果见表1。

表1 氧化亚铁硫杆菌耐钼驯化试验结果

经过342 d的驯化，氧化亚铁硫杆菌的耐钼质量浓度从560 mg/L升高到了820 mg/L。由于钼对氧化亚铁硫杆菌有较强的毒害作用，在驯化培养过程中，一定要注意钼浓度的增长梯度。本驯化试验钼质量浓度每次增长10～20 mg/L，每个浓度重复驯化2～3次，使细菌充分适应溶液环境；随着重复驯化次数的增加，细菌的培养时间相应缩短。

2.2 L.f菌和野生菌的耐钼驯化结果

经过多次转接驯化，氧化亚铁钩端螺旋菌和野生菌株LM1的耐钼浓度均得到提高，耐钼驯化结果见表2～3。

表2 L.f菌耐钼驯化试验结果

表3 野生菌株LM1耐钼驯化试验结果

由表2～3可看出，L.f菌经过145 d驯化，其耐受钼浓度从100 mg/L升高到了620 mg/L；野生菌株LM1经过148 d驯化，其耐受钼浓度从100 mg/L升高到了580 mg/L。而氧化亚铁硫杆菌经过一年驯化耐受钼浓度达到550 mg/L，这表明L.f菌和野生菌株LM1对耐钼驯化的适应性强于氧化亚铁硫杆菌。试验表明，当某一浓度下驯化周期较长时，可通过在同一浓度梯度下反复驯化或降低浓度梯度的方法缩短驯化周期。

3 野生菌株的生理生化特性研究及分子生物学鉴定

3.1 菌落及菌体形态

菌株LM1在固体培养基平板上菌落较小，呈半透明，圆形，中间凸起，直径约15～20 μm(图1)。光学显微镜下观察LM1菌体，可见菌体较小，杆状，能运动；革兰氏染色阴性，菌体呈红色(图2)。在透射电子显微镜下观察菌体，可见有单根鞭毛，近端生，细胞直径约0.4～0.6 μm，长度约2～2.5 μm(图3)。

图1 LM1菌落形态

图2 LM1革兰氏染色结果

图3 LM1透射电镜照片

3.2 LM1生长曲线

按培养基体积10%的量接种菌株于灭菌9K培养基中，在28 ℃摇床恒温培养，做3组平行试验，在培养一定时间后取样测OD420(420 nm波长下样品吸光度)，用未接种的9K培养基作为对照。LM1生长曲线如图4所示。可以看出，LM1在28 ℃下摇床培养，在20～30 h快速生长，30 h后达到稳定期。

图4 LM1生长曲线

3.3 LM1最适培养条件

3.3.1 LM1生长温度

按培养基体积10%的量接种纯化菌株于灭菌9K培养基中，在摇床中恒温培养，培养温度分别是25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃，每个温度做5组平行试验，48 h后测OD420，用未接种的9K培养基作为对照。LM1生长温度曲线如图5所示。可以看出，30 ℃为LM1最适生长温度，低于30 ℃的培养温度对LM1生长显著抑制；高于30 ℃的培养温度，菌体生长也受到抑制。

图5 LM1生长温度曲线

3.3.2 LM1生长pH

按培养基体积10%的量接种菌株于灭菌9K培养基中，在30 ℃摇床恒温培养，培养基pH分别是0.0、1.0、2.0、3.0，每个pH条件做5组平行试验，48 h后测OD420，用未接种的9K培养基作为对照。LM1生长pH曲线如图6所示。可以看出，LM1最适生长pH为2.0～2.5；pH<1，菌体不生长；pH>2.5，菌体生长受到抑制。

图6 LM1生长pH曲线

3.3.3 LM1能源利用情况

在不含Fe2+的100 mL 9K液体培养基中分别加入1%的单质硫、4.31%的FeSO4·7H2O、4.31%的FeSO4·7H2O+1%的单质硫、1%的Na2S2O3·5H2O；其中Na2S2O3·5H2O、FeSO4·7H2O均采用0.22 μm超滤膜过滤除菌后再加入培养基，单质硫隔水蒸煮1 h后再加入培养基。按培养基体积1%的量接种，30 ℃下摇床培养3 d后测OD420，用各组未接种的培养基作为对照。LM1能源利用情况如图7所示。可以看出，LM1不能以Na2S2O3为唯一能源生长，在以S为唯一能源时生长微弱，在含Fe2+的培养基中生长旺盛。

图7 LM1能源利用情况

3.4 LM1菌株16S rDNA鉴定

采用TianGen细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。PCR扩增采用细菌16S rDNA通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1541r (5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)。PCR反应体系(50 μL)组成：MgCl2(1.5 mmol/L)、基因组DNA (10 ng)、dNTP (200 μmol/L)、引物(0.4 μmol/L)和Taq DNA聚合酶(1.25 U)。PCR反应条件：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环。PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，转化E.coli DH5α。

PCR扩增获得了LM1的16S rDNA核苷酸片断，大小为1 526 bp，并获得其核苷酸序列。重组质粒由上海生工完成测序，将所得16S rDNA序列在http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行N Blast，选出相似性大于98%的部分序列，进行系统进化树分析[10]。通过序列相似性比对和进化树关系比对，可得出该菌为氧化亚铁硫杆菌(AcidithiobacillusferrooxidansLM1)。

4 结论

通过驯化可以有效提高细菌对钼的耐受能力，其驯化速度与菌株本身性质有关。当驯化周期较长时，可通过在同一浓度梯度下重复驯化或降低浓度梯度的方式缩短驯化周期。氧化亚铁硫杆菌通过365 d驯化，其耐受钼质量浓度达到550 mg/L；经过707 d的驯化，其耐钼质量浓度达到了820 mg/L。氧化亚铁钩端螺旋菌通过145 d驯化，其耐受钼质量浓度达到620 mg/L。野生菌株LM1通过148 d驯化，其耐受钼质量浓度达到580 mg/L。

野生菌LM1在28 ℃下的生长周期为30 h，最适生长温度为30℃，最适生长pH为2.0～2.5，不能以Na2S2O3为唯一能源生长，在以S为唯一能源时生长微弱，在含Fe2+的培养基中生长旺盛。野生菌LM1为革兰氏阴性菌，菌体杆状，近端生鞭毛，能运动；固体培养基上生长菌落小，半透明，圆形，中间凸起；分子生物学鉴定结果表明该菌株为嗜酸氧化亚铁硫杆菌(AcidithiobacillusferrooxidansLM1)。