孔雀石绿胶体金检测样品前处理工艺的优化

高海岗， 刘秀梵*， 王晓泉， 蒋春茂， 郑砚超

（1.扬州大学，江苏扬州225009；2.江苏农业职业技术学院，江苏泰州225300；3.无锡中德伯尔生物技术有限公司，江苏无锡214174）

孔雀石绿又叫孔雀绿、碱性绿，是一种人工合成的三苯甲烷类燃料（陈义元，2018），因其在细菌合成过程中能阻止蛋白肽的形成而具有杀菌效果，被广泛用于水产养殖和运输领域。但孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿（LMG）具有致癌、致畸和致突变毒性， 已被多国禁用，2002 年农业部颁布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中明确禁止使用孔雀石绿等多种违禁药物。 但多年来的检测结果显示， 我国部分省市在养殖领域和流通领域还在长期使用（师真等，2020；林锏锐等，2019；范芳芳等，2019），严重危害农产品食用安全。

根据文献报道和相关检测数据显示，国内市面上出售的水产品中孔雀石绿、 硝基呋喃类药物、 氯霉素的检出率为6.5% ～ 23.2%（李菊等，2020）。 为快速监测养殖领域和流通领域违法使用兽药，我国出现了大量的快速检测试剂盒和检测试纸条。 目前前处理方法一般为使用乙腈、二氯甲烷提取，硼氢化钾等进行还原，使孔雀石绿还原成隐性孔雀石绿检测（刘柳等，2020；王雪峰等，2018）；或者直接用乙腈提取，中性氧化铝净化，直接上机检测（朱飞如和冯俊富，2018）。但由于前处理方法过于复杂，仍然不能保证在有限的时间内，快速、准确的检测违禁药物。本实验采用提取、氧化、浓缩和复溶四个步骤，对氮吹、SPE柱、 反萃取三种不同提取方式进行前处理比较，通过胶体金免疫层析试纸条进行检测，旨在对建立基层快速检测方法提供指导性建议。

1 材料与方法

1.1 试剂 孔雀石绿快速检测试纸条、SPE-HLB柱，由无锡中德伯尔生物技术有限公司提供；氯化钠、盐酸羟胺、乙酸钠、甲醇、无水硫酸钠、中性氧化铝、乙酸乙酯、四氯苯醌、乙腈、吐温-20 均为分析纯，购自国药集团；隐性孔雀石绿、孔雀石绿标准品，购自德国DR.E。

1.2 仪器 振荡器，购自其林贝尔仪器制造有限公司；离心机，购自万合仪器制造有限公司；氮吹仪，购自无锡中德伯尔生物技术有限公司；固相萃取装置，购自冠森生物科技（上海）有限公司。

1.3 前处理实验方法

1.3.1 现行行业标准 （kj201701） 样本的提取：准确称取试样2 g（精确至0.01 g）置于15 mL 具塞离心管中，用红色油性笔标记，依次加入1 mL饱和氯化钠溶液，0.2 mL 盐酸羟胺溶液，2 mL 乙酸盐缓冲液及6 mL 乙腈，涡旋提取2 min（食品快速检测方法数据库，2021）。 氧化和浓缩： 加入1 g 无水硫酸钠，1 g 中性氧化铝， 涡旋混合1 min，以4600 r/min 离心5 min。 准确移取5 mL 上清液于15 mL 离心管中， 加入1 mL 正已烷， 充分混匀，以4600 r/min 离心1 min。 准确移取4 mL 下层液于15 mL 离心管中， 加入100 μL 二氯二氰基苯醌溶液，涡旋混匀，反应1 min，于55 ℃水浴中氮气吹干。 复溶：精密加入200 μL 复溶液，涡旋混合1 min，作为待测液，立即测定。

1.3.2 氮吹改良方法 样本的提取：称取去皮、去脂肪并均质的样本5 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管，加入适量的标准品，依次加入3 mL 饱和氯化钠溶液， 7 mL 乙酸乙酯，于振荡器上剧烈振荡3 min，4000 r/min 离心5 min； 氧化和浓缩：取上清4 mL 于7 mL 离心管中， 加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液， 振荡混匀后， 置于氮吹仪中，65 ℃加热吹干；复溶和净化：取出上述7 mL离心管， 加入2 mL 正己烷， 轻轻振荡至溶解残渣，再加入0.8 mL 0.5%吐温-20 水溶液，于振荡器上剧烈振荡1 min，4000 r/min 离心1 min。取出离心管后，去除上层正己烷，下层溶液即为待测液。

1.3.3 反萃取方法 样本的提取方法同1.3.2；氧化和调整极性：取上清4 mL 于15 mL 离心管中，加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液，振荡混匀后，加入10 mL 正己烷，于振荡器上剧烈振荡3 min；反萃取：取出上述15 mL 离心管，加入500 μL 0.2 mol/L 硼酸溶液， 于振荡器上剧烈振荡1 min，4000 r/min 离心1 min， 去除上层有机相，取下层溶液400 μL 于2 mL 离心管中，再加入400 μL 0.05 mol/L 四硼酸钠溶液， 混匀后即为待测液。

1.3.4 SPE 柱法 样本的提取方法同1.3.2；氧化和调整极性：取上清4 mL 于15 mL 离心管中，加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液， 振荡混匀后， 加入10 mL 正己烷， 于振荡器上剧烈振荡3 min；SPE 吸附：将上述液体按0.6 mL/min 的速度，匀速过HLB 小柱；SPE 洗脱： 加入1 mL 10%甲醇-水溶液于上述SPE 柱中， 按每秒一滴的速度匀速洗脱，洗脱液即为待测液。

1.4 质控实验 每种样品同时进行空白实验和加标质控实验。

1.4.1 空白实验 称取鱼肉样本， 按照1.3 中不同方法进行样本制备。

1.4.2 加标质控实验 准确称取空白样本适量，按照梯度加入一定量的孔雀石绿标准液， 使孔雀石绿浓度为0.25、0.5、1、2、4 ng/mL；准确称取空白样本适量， 按照梯度加入一定量的隐性孔雀石绿标准液，使孔雀石绿浓度为0.25、0.5、1、2、4 ng/mL。

1.5 胶体金免疫层析试纸条使用方法及判读示意图

1.5.1 使用方法 （1）从原包装铝箔袋中取出检测卡和酶标孔，恢复至室温；（2）用移液器吸取待检样品溶液100 μL 于酶标孔中， 反复吹打至孔内红色物质完全溶解，等待反应2 min；（3）将检测卡平放，吸取孔内所有溶液滴加到加样孔中，加样后开始计时；（4）反应5 min 根据示意图判断结果，其他时间判读无效。

1.5.2 结果判读 胶体金免疫层析试纸条判读示意图如图1 所示。 阴性结果：T 线比C 线深，或一样深，表示样本中孔雀石绿浓度低于其检测限；阳性结果：T 线比C 线浅，或T 线显绿色，表示样本中孔雀石绿浓度高于其检测限；无效反应：如果测试结果C 线未出现，表示此试剂已失效。

图1 胶体金免疫层析试纸条判读示意图

2 结果与分析

2.1 灵敏度比对 分别用行标法以及本实验中的三种前处理方法进行最低检测限，其中氮吹的最低检测限最低，为隐性孔雀石绿0.5 ng/mL。 SPE 方法的最低检测限为隐性孔雀石绿1 ng/mL。 反萃取方法和行标法的最低检测限最高，为隐性孔雀石绿2 ng/mL（图2）。

图2 不同浓度的LMG 检测结果

2.2 四种方法准确性比对 分别测试了行标法以及本实验中三种前处理方法的准确性， 在0、0.25、0.5、1、2、4 ng/mL 六种加标浓度下， 每种方法每个浓度分别测试20 份样本，每种浓度下显示的阴阳性数量如表1。 在阴性、检出限及2 倍检出限这三个浓度点上， 四种方法的准确性均为100%；特别考察了半数检出限的准确性，其中改良氮吹法准确性最高，假阳性率为10%，行标法假阳性率为15%，反萃取法假阳性率为25%，SPE方法假阳性率最高，为40%。

表1 四种方法不同浓度下的阴阳性数量

2.3 行标法及改良的三种方法前处理用时比对分别对比了行标法以及本实验中三种前处理方法的用时，结果见表2。 其中，反萃取法由于省略了氮吹、过柱等步骤，用时最短，只需要23 min；SPE 法过柱洗脱时间明显短于氮吹浓缩的时间， 用时32 min； 改良氮吹法相对于行标法减少了试剂加入量，且乙酸乙酯挥发更快，用时41 min；行标法用时最长，需要48 min。

表2 四种方法前处理用时 min

3 讨论

试剂盒是否能用于临床检验， 一般通过准确率、假阳性率、假阴性率、变异系数、提取率、特异性、操作步骤和检测时间来判断（李菊等，2020）。在胶体金检测卡的开发中， 主要考量的是准确性和灵敏度，而对于胶体金的广泛使用，前处理的工艺显得尤为重要，在操作步骤、提取率和提取时间上的优化，能够使检测变得更快捷，更易于基层推广使用。

根据GB31650-2019，孔雀石绿为0.5 ng/mL，行业快检要求检测限孔雀石绿为2 ng/mL。 本文对三种同时检测隐性孔雀石绿前处理方法进行研究和比较， 该三种方法都能达到同时检测隐性孔雀石绿效果。 其中改良氮吹法的最低检测限能达到国标方法的最低检测限，反萃取方法和SPE 方法的最低检测限也都符合国家快检方法的最低检测限要求。相比于国标方法，该三种方法无论从时间、成本、操作难度等方面，都具有很大优势，对我国水产养殖行业的监管具有积极意义。

反向萃取法用时最短， 提取率较其他两种方法偏低。SPE 方法油脂等杂质去除的最干净，但成本高，操作要求严格。 改良氮吹方法提取率最高，但用时较长。

本实验对三种前处理方法与行标法进行对比，在阴性、 检出限及2 倍检出限这三个浓度点上，四种方法的准确性均为100%； 半数检出限的准确性存在较大差异， 其中改良氮吹法准确性最高，假阳性率为10%，行标法假阳性率为15%，反萃取法假阳性率为25%，SPE 方法假阳性率最高，为40%。 出现半数检出限假阳性的原因可能是氮吹后油脂残留过多，SPE 过柱时流速不稳定等原因造成的。 但具体的影响因素和影响机理，如何减弱或尽量避免这些影响因素， 都有待进一步研究。

反向萃取法从样品提取到检测，用时最短，总时间不超过45 min，在限值范围内，准确率最高，能够避免使用其他大型仪器， 方便基层的快速使用，使建立第三方快速检测实验室成为可能。