遗传算法优化超声辅助低共熔溶剂提取红枣总黄酮工艺研究

李 栋

（吕梁学院生命科学系，山西吕梁033000）

红枣是鼠李科（Rhamnaceae）枣属植物枣树（Ziziphus jujuba Mill.）的成熟果实，在我国有着悠久的种植历史。红枣中富含黄酮、皂苷、色素、各种维生素和抗氧化酶等活性成分， 其中红枣黄酮是红枣中最重要的活性成分之一（吴添文，2015）。研究证实红枣黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和促进淋巴细胞增殖等功效（张砚垒等，2020）。红枣中黄酮提取是红枣产业中最关键的环节。因此，寻找绿色高效提取技术从红枣中提取黄酮是当前研究的热点。

目前， 从天然植物资源中提取活性成分通常采用常规溶剂（甲醇、乙醇、乙酸乙酯等），但这些溶剂易挥发，造成环境污染（Wang 等，2019）。 为克服传统溶剂的缺陷，近年来低共熔溶剂（DESs）作为传统溶剂的绿色替代品得到了广泛的应用。DESs 作为新一代的液体盐， 通常是由氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）按照一定比例相互混合而制得。氯化胆碱通常作为HBA。葡萄糖、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、乙二醇和甘油通常作为HBD。自DESs 提出以来， 已成功应用于酚酸 （周惠燕等，2019）、生物碱（Tan 等，2016）和多糖（熊苏慧等，2018）的提取当中。此外，绿色提取的另一个方式是通过使用潜在的创新技术（例如超声）来降低能耗。利用超声所产生的“机械效应”、“空化效应”和“热效应”，加速植物细胞壁的破裂，降低目标成分由内向外的传递阻力， 进而有效提高目标成分得率（Zhang 等，2018）。 目前，利用超声辅助低共熔溶剂提取红枣总黄酮的研究鲜见报道。 除提取技术外， 红枣总黄酮得率还取决于许多其他因素（萃取温度、萃取时间、料液比和超声功率）。因此，优化红枣总黄酮的提取条件是提高其得率的关键。 遗传算法（GA）具有全局寻优的特点，能取得较好的预测和优化效果。目前，采用该方法对红枣总黄酮的提取条件进行优化的研究鲜见报道。 鉴于此， 本研究采用超声辅助低共熔溶剂提取技术对红枣总黄酮进行提取，探究含水量、超声功率、提取时间、 提取温度和料液比对红枣总黄酮得率的影响，并通过GA 优化其提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 红枣，吕梁木枣；氯化胆碱，河北陌槿生物科技有限公司；1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、丙三醇和乙二醇，苏州市森菲达化工有限公司；亚硝酸钠，常州市启迪化工有限公司；硝酸铝，上海金锦乐实业有限公司；氢氧化钠，宜昌佳茂化工有限公司；葡萄糖，上海澄绍生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备 YM-1000CT 超声波提取仪，上海豫明仪器有限公司；FA1004 分析天平， 绍兴万力仪器有限公司；UV759 紫外可见分光光度计， 青岛聚创环保集团有限公司；TG18K-Ⅱ型高速离心机， 上海赵迪生物科技有限公司；FD-1A-50 真空冷冻干燥机，江苏天翎仪器有限公司；JJ-2 植物粉碎机，常州市万丰仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 将新鲜的红枣用清水冲洗干净，然后用刀子剔除枣核并切成丝状，置于60 ℃干燥机中将其烘干，然后用植物粉碎机将其粉碎，过40 目筛，将制的红枣粉末密封避光保存备用。1.3.2 DESs 溶剂制备 不同种类DESs 溶剂可显著影响黄酮提取效果， 因此在提取红枣黄酮前首先要筛选合适的DESs 溶剂。 参考Wang 等（2019） 方法以氯化胆碱为HBA，1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、丙三醇、乙二醇和葡萄糖为HBD。将两者按照表1 中的摩尔比混合，在80 ℃恒温水浴中搅拌至形成澄清的液体，即为制得DESs 溶剂。1.3.3 红枣总黄酮提取 称取10.00 g 红枣粉末置于具塞三角瓶中， 按照一定料液比加入不同含水量的DESs 溶剂，用玻璃棒搅拌使其充分混合，将其置于超声提取设备中，通过仪器控制面板，设置超声功率、 超声时间和超声温度， 待提取结束后，将提取物置于离心机中以7000 r/min 离心15 min，真空抽滤获得滤液，残渣重复上述操作，合并滤液，滤液即为总黄酮提取液。

1.3.4 总黄酮得率测定 利用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定红枣总黄酮含量， 具体操作步骤参考孙平等（2020）测定野菊花总黄酮的步骤，不同提取条件下红枣总黄酮得率的计算公式如下：

表1 不同类型DESs 溶剂

式中：Y 为总黄酮得率，mg/g；V0为定容后提取液的体积，mL；V1为样品总体积，mL；V2为测定用体积，mL；c 为红枣的质量浓度，mg/mL。

1.3.5 单因素试验 选择超声辅助低共熔溶剂法作为红枣总黄酮的提取方法， 操作同1.3.3。 以10.00 g 红枣粉末为提取对象， 对含水量 （10%、20%、30%、40%、50%）、 超声功率（100、150、200、250、300 W）、提取时间（10、20、30、40、50 min）、提取温度（40、45、50、55、60 ℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL）5 个因素进行单因素试验，讨论试验因素对样品总黄酮得率的影响。

1.3.6 响应面法试验 在单因素试验的基础上，以含水量（X1）、超声功率（X2）、提取温度（X3）和料液比（X4）为自变量，以总黄酮得率（Y）为响应值。根据Design-Expert 8.0.6 中的Box-Behnken 试验原理设计组合试验，因素与水平设计如表2 所示。

表2 试验设计因素与水平

采用响应面分析法得到的二次回归模型为：

式中：b0为截距回归系数；bi为线性回归系数；bii为二次项的回归系数；bij为交互项的回归系数；Xi，Xj为自变量。

1.3.7 遗传算法设计 依据单因素试验结果，选取含水量（X1）、超声功率（X2）、提取温度（X3）和料液比（X4）4 个因素为决策变量，即：

X=X（X1， X2， X3， X4）；

如X（t）满足式以下公式，表明迭代终止。

则最优解，X*（t），对应的Y*为最优值，即为最佳的输出向量。 此时红枣总黄酮得率的目标函数为：

式中：f（x）为RSM 模型得到的红枣总黄酮得率的目标函数；n 为自变量个数；XiL和XiU分别为X 的上限和下限。

遗传算法优化的约束条件：选择各因素水平的上下限，总黄酮得率最优的约束条件如下式所示：

1.4 数据处理 每组试验重复3 次，结果用“平均值±标准差”表示；采用Statistix8.0 软件对试验数据进行方差分析（ANOVA）；采用Matlab 2015b优化超声辅助低共熔溶剂提取红枣总黄酮工艺参数；Design-Expert 8.0.6 设计组合试验和利用Origin9.0 进行单因素绘图。

2 结果与分析

2.1 不同DESs 溶剂对红枣总黄酮得率的影响不同类型DESs 溶剂具有不同导电性、密度、黏度和溶解度等物化参数， 这些参数均能影响目标成分提取效果（Rois Mansur 等，2019）。 本研究以氯化胆碱作为氢键受体， 选用1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、丙三醇、乙二醇和葡萄糖作为氢键供体，按照不同摩尔比进行充分混合制备不同种类的DESs 溶剂，其对红枣总黄酮得率的影响结果如图1 所示。

图1 不同DESs 溶剂对红枣总黄酮得率的影响

由图1 可知， 不同类型的DESs 溶剂对红枣总黄酮得率的影响大小顺序为DESs-6>DESs-4=DESs-5>DESs-2>DESs-1=DESs-3>DESs-7=DESs-8>DESs-10>DESs-9。 其中采用DESs-6 作为溶剂所得红枣总黄酮得率最大， 为 （26.52±0.28）mg/g。分析其原因可能是氯化胆碱与1，4-丁二醇混合制备的低共熔溶剂（DESs-6）与黄酮极性相似，使得总黄酮在溶剂中溶解度较大（Huang等，2019）；此外溶剂表面张力和黏度较低，易于黄酮从细胞内扩散到溶剂中，增加总黄酮得率（Xiao等，1991）。 综上，最终选择DESs-6 作为红枣总黄酮的最佳提取溶剂，用于后续试验。

2.2 单因素对红枣总黄酮得率的影响 单因素对红枣总黄酮得率的影响结果如图2 所示。 由图2A 可知，当含水量为10% ～ 30%时，红枣总黄酮得率随含水量增加呈现显著增加的趋势 （P <0.05）。 其原因是含水量增加可有效地减弱DESs的氢键和溶剂表面张力，造成溶剂黏度迅速下降，有利于提高黄酮的溶解度和传质速率， 进而使得总黄酮得率增加（Wang 等，2020）。 当含水量超过30%，继续增加溶剂中的水分含量红枣总黄酮得率反而显著降低（P<0.05）。 其原因是含水量增加使得溶液中的极性增强，不利于黄酮提取，因此总黄酮得率降低（Bi 等，2013）。 综上， 选择含水量为20%、30%和40%三个水平进行后续的组合试验。

由图2B 可知， 当超声功率为100 ～ 200 W时， 红枣总黄酮得率随超声功率增加呈显著增加的趋势（P < 0.05）。 其原因是随超声功率增加，超声产生的“空化效应”破坏红枣细胞壁程度增加，黄酮由内向外的传递阻力明显降低， 扩散系数和溶解速度均明显增加有利于总黄酮的提取（张世奇等，2020）。当超声功率超过200 W，随超声功率增加总黄酮得率呈显著降低的趋势（P < 0.05）。其原因是高强度超声功率会破坏黄酮结构， 不利于黄酮提取（赵强等，2020）。 综合考虑，本试验选择超声功率为100、150 W 和200 W 三个水平进行后续组合试验。

由图2C 可知，当提取时间为10 ～ 30 min，随提取时间延长红枣总黄酮得率呈现显著增加的趋势（P < 0.05）。其原因是在提取初期，超声“空化效应” 促进总黄酮由内向外扩散， 增加总黄酮得率（张世奇等，2020）。但当提取时间超过30 min 时，由于大多数总黄酮已经被溶出， 故总黄酮得率随提取时间的延长无显著变化（P < 0.05）。 综合考虑，本试验选择提取时间为30 min，后续不再进行提取时间优化。

由图2D 可知， 当提取温度为40 ～ 50 ℃，随提取温度升高红枣总黄酮得率显著增加 （P <0.05），提取温度为50 ℃时，总黄酮得率取得最大值（26.07±0.45）mg/g。这是由于随温度升高，黄酮溶解度和扩散系数增加，有利于总黄酮从细胞溶出，增加总黄酮得率（王昭珺等，2020）。但当提取温度超过50 ℃， 随提取温度升高总黄酮得率反而显著降低（P < 0.05）。 其原因是高温影响黄酮提取（霍丹群等，2014）。综合考虑，本试验选择提取温度为45、50 ℃和55 ℃三个水平进行后续组合试验。

图2 不同试验因素对红枣总黄酮得率的影响

由图2E 可知，红枣总黄酮得率随料液比增加呈现先显著增加后显著降低的趋势 （P <0.05），当料液比为1∶25（g/mL）时，总黄酮得率取得最大值（27.19±0.29）mg/g。 其原因是随溶剂增加，固液界面的浓度梯度增加，浓度梯度作为黄酮由内向外的传质驱动力，驱动红枣黄酮扩散，使得得率增加（张贞发等，2021）。 但如果溶剂过多，会造成大量杂质溶剂；此外，还增加后期分离纯化的成本（叶丽等，2020）。 综上考虑，料液比选择1∶20、1∶25 和1∶30（g/mL）三个水平进行后续组合试验。

2.3 响应曲面法试验结果

2.3.1 模型建立与显著性检验 通过遗传算法优化超声辅助低共熔溶剂提取红枣总黄酮的工艺，所得的试验方案和结果见表3。以总黄酮得率（Y）为响应值， 对试验所得的数据进行多元回归拟合分析，同时剔除不显著项，得到红枣总黄酮得率对含水量（X1）、超声功率（X2）、提取温度（X3）和料液比 （X4） 的回归模型：Y=28.20+0.76X1+0.69X2+0.96X3+0.21X4+0.35X1X3-0.70X12-0.99X22-0.83X32-0.48X42。

对回归方程系数进行显著性检验， 结果如表4 所示。 由表4 可知， 数学模型决定系数R2=0.9749，F=38.85，P < 0.0001。 结果表明通过RSM建立的数学模型极显著。 该模型失拟项P =0.1132>0.05，表明模型失拟项不显著。 通过以上数据分析表明，通过RSM 所建立的数学模型对试验数据拟合充分，可靠性较好。

利用F 值大小可以判断试验因素对响应值的影响程度，F 值越大，说明该因素对响应值的影响越显著。 由表4 可知，F （X1）=99.63、F （X2）=102.04、F（X3）=187.53 和F（X4）=7.51，即各试验因素对红枣总黄酮得率的影响顺序为提取温度（X3）>超声功率（X2）>含水量（X1）>料液比（X4），且含水量、 超声功率和提取温度对红枣总黄酮得率的影响达到极显著水平（P < 0.0001）。

表3 响应曲面法试验设计及结果

由图3A 可知， 通过试验测定的总黄酮得率的真实值与RSM 模型预测的总黄酮得率值基本一致。结果表明可以通过RSM 模型来预测不同提取条件下红枣总黄酮得率。 由图3B 可知，在本试验中所得的总黄酮得率试验值均遵循正态分布，且没有偏离方差。 由图3C 可知，所有试验点的学生化外残差范围均在±3 内。 此外，由图3D 可知，多项式模型的Cook’s 距离均在1.0。 结果表明本试验所得的总黄酮得率没有异常值。 综上进一步验证采用RSM 模型预测不同提取条件下总黄酮得率是准确可靠的。在此基础上，进一步采用遗传算法优化超声辅助低共熔溶剂提取红枣总黄酮是合理可行的。

表4 红枣总黄酮工艺优化回归模型系数的显著性检验报告

2.3.2 交互项分析 利用等高线图形来判断因素交互作用对响应值的影响程度是否显著。当等高线图形为椭圆时，代表因素交互作用显著影响响应值变化（张贞发等，2021）；当等高线图形为圆形时，代表因素交互作用对响应值变化无显著影响（李艳艳等，2020）。 由表4 方差分析结果可知，X1X2、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4的 交 互 作 用 均对红枣总黄酮得率无显著影响（P > 0.05），故在此不做分析。X1X3的交互作用显著影响红枣总黄酮得率（P < 0.05）。由图4 可知，红枣总黄酮得率随含水量增加和提取温度升高均呈现先增加后降低的趋势， 总黄酮得率在中心处取得极值点。并且等高线呈现椭圆型， 表明X1X3的交互作用显著影响红枣总黄酮得率。 综上可知，对红枣总黄酮得率影响因素顺序为提取温度（X3）>超声功率（X2）>含水量（X1）>料液比（X4），该结果也与方差分析的结果一致。

图3 模型充分性检验图

2.3.3 红枣总黄酮提取工艺参数优化 利用Matlab R2018b 软件中的遗传算法优化工具箱进行分析优化，迭代71 次，红枣总黄酮得率取得最大值，此时含水量（X1）、超声功率（X2）、提取温度（X3）和料液比（X4）水平编码分别为0.726、0.348、0.731、0.219， 即试验水平分别为37.26%、167.4 W、53.655 ℃和1∶26.095（g/mL），在此条件下，所得红枣总黄酮得率理论值为28.97 mg/g。 遗传算法M 文件运行结果如图5 所示。

图4 各试验因素交互作用的响应面和等高线图

图5 遗传算法优化结果

2.3.4 试验验证 为验证遗传算法的可靠性，结合实际情况， 将上述工艺参数修正为： 含水量37%、超声功率167 W、提取温度54 ℃和料液比1∶26（g/mL），按照上述因素水平进行三次重复试验，所得红枣总黄酮得率为（29.33±0.37）mg/g，试验值和理论值的相对误差为1.24%。 研究结果表明遗传算法可较好地模拟和预测不同提取条件下红枣总黄酮得率， 进一步证明利用该方法优化超声辅助低共熔溶剂提取红枣总黄酮工艺参数是可行的。

3 结论

本研究通过遗传算法优化超声辅助低共熔溶剂提取红枣总黄酮工艺，得到最优工艺参数为：含水量37%、超声功率167 W、提取时间30 min、提取温度54 ℃和料液比1∶26（g/mL）。 在此条件下，所得红枣总黄酮得率为（29.33±0.37）mg/g。试验值和理论值的相对误差为1.24%。 表明遗传算法可较好地模拟和预测红枣总黄酮得率， 且优化工艺参数是可行的。 研究结果为红枣总黄酮提取提供了一种绿色高效的提取方法。