气相色谱质谱法测定水产饲料中16 种多环芳烃的方法研究

李德祥， 张艳红， 张凤枰*， 邹昌健

（1.四川威尔检测技术股份有限公司，四川成都610041；2.通威股份有限公司水产畜禽营养与健康养殖农业农村部重点实验室，四川成都610093；3.通威股份有限公司水产健康养殖四川省重点实验室，四川成都610093）

多环芳烃（PAHs）是指分子中含有2 个或者2 个以上苯环的碳氢化合物，其是由煤、石油、木材、有机高分子化合物等不完全燃烧产生的，其化学性质稳定，不易水解，具有生物累积性、难降解、致癌极强等特点 （赵文昌等，2006； 杨发忠等，2005； 岳敏等，2003）。 美国国家环境保护总署（EPA） 把其中16 种PAHs 列入优先控制污染物名单（Usepa，1984），2005 年欧盟发布的《关于多环芳香烃的指令》（PAHs 指令2005/69/EC），限制包含苯并芘（Bap）在内的16 种PAHs 的使用。 水产饲料为养殖水生动物生长提供所需的营养物质，在大自然环境中，多环芳烃通过食物链传递形式使其原料受到污染， 导致水产饲料中含有多种多环芳烃， 并通过食物链传递方式侵入水产品体内，最终向人体转移、聚集，危害人类的健康（任宪云，2014； 王 汨，2013；Zhao 等，2013；Roggo 等，2013；丰培娟，2011；Oost 等，2003）。 目前，有关饲料中多环芳烃检测研究的报道甚少。 Nácher Mestre Jaime 等（2014）采用气相色谱-高分辨质谱测定饲料和鱼体组织中的多环芳烃含量； 彭志通等（2016）报道了气相色谱质谱法快速测定饲料用油脂中16 种多环芳烃。 近年来国内外多环芳烃检测技术发展迅速， 多环芳烃测定方法主要有液相色谱法（汪晨霞等，2018；Zhu 等，2015）、气相色谱-质谱联用法（Kalachova 等，2011）、气相色谱-三重四级杆串联质谱联用法 （Portolés 等，2017）、气相色谱-三重四级杆-飞行时间质谱联用法（Na′cher-Mestre 等，2009）和气相色谱-高分辨质谱联用法（Woudneh 等，2016）等。多环芳烃的提取方法主要有超声提取法（刘保献等，2015）、微波辅助萃取法（王成云等，2018）和加速溶剂萃取法（王道玮等，2013） 等， 净化方法主要有固相微萃取（Yebra-Pimentel 等，2013）和凝胶色谱净化法（王峰等，2014）。 本文采用超声提取、全自动凝胶色谱技术对水产饲料样品中的多环芳烃进行提取和净化，以苊-D10、蓝屈-D12和苯并（a）芘-D12为内标物（GB/T 23213-2008），采用同位素内标法校正目标化合物在前处理过程中的损失，降低基质效应，旨在建立超声提取-凝胶色谱净化-气相色谱质谱联用定量测定水产饲料中16 种多环芳烃含量的方法，为饲料生产企业多环芳烃污染控制提供检测方法依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、 试剂和材料 7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；Free style 全自动凝胶渗透色谱系统 （德国LC Tech 公司）；CP224S 电子天平（德国Sartorius 公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Allegra 64R 冷冻离心机 （美国Beckman Coulter 公司）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI 公司）；氮气浓缩仪、WH-3 微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器有限公司）。

16 种多环芳烃混合标准溶液（200 μg/mL，美国O2si 公司）；苊-D10、蓝屈-D12和苯并（a）芘-D12混合标准溶液（1000 μg/mL，美国O2si 公司）；正己烷、乙酸乙酯、环己烷，均为色谱纯；水产饲料样品，通威股份有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 苊-D10、 蓝屈-D12和苯并（a）芘-D12混合内标工作溶液：准确移取适量苊-D10、蓝屈-D12和苯并（a）芘-D12混合标准溶液，用正己烷配制成2.0 μg/mL 内标混合工作溶液，摇匀，备用。

多环芳烃混合标准工作溶液： 准确移取适量16 种多环芳烃混合标准溶液，加入适量苊-D10、蓝屈-D12和苯并（a）芘-D12混合内标溶液，用正己烷稀释成浓度分别为0、2、5、10、50、100、200 ng/mL 的多环芳烃混合标准工作溶液，苊-D10、蓝屈-D12和苯并（a）芘-D12的浓度均为50 ng/mL，摇匀，备用。

1.2.2 样品前处理 样品提取：称取5 g（精确到0.01 g） 水产饲料试样于50 mL 离心管中， 加入100 μL 2 μg/mL 混合内标工作溶液， 加入20 mL正己烷， 高速漩涡混合1 min， 超声20 min，8000 r/min 离心5 min， 将上清液转移至100 mL梨形瓶中；将残渣用20 mL 正己烷溶液重复提取两次，离心后合并上清液于梨形甁中，于40 ℃水浴中旋转浓缩至约1 mL，氮吹至近干，用乙酸乙酯+环己烷（1+1）溶液定容至10 mL，漩涡混合溶解，待净化。

净化：将凝胶色谱仪调至最佳工作状态，试样由5 mL 试样环注入凝胶渗透色谱（GPC）柱，泵流速5.0 mL/min，用乙酸乙酯+环己烷（1+1）洗脱，弃去0 ～20 min 流分， 收集20 ～55 min 流分，55 ～60 min 冲洗GPC 柱， 将收集液于40 ℃水浴中旋转蒸发浓缩至约1 mL，氮吹至近干，准确加入1 mL乙酸乙酯+环己烷 （1+1）， 漩涡混合1 min，过0.22 μm 微孔滤膜，待GC-MS 测定。

1.2.3 色谱质谱条件 色谱柱：HP-5 MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升温：初始温度90 ℃，以20 ℃/min 的速率升温至180 ℃，以5 ℃/min 的速率升温至270 ℃， 再以3 ℃/min 的速率升温至310 ℃，保持2 min；进样口温度：260 ℃；色谱-质谱接口温度：310 ℃；离子源温度：230 ℃；载气：氦气，流速1.0 mL/min，纯度≥99.999%；电离方式：EI；离子化能量：70 eV；测定方式：选择离子监测方式；进样量：1.0 μL；进样方式：不分流进样；溶剂延迟：3 min。

2 结果与讨论

2.1 饲料样品提取溶剂的选择 多环芳烃为脂溶性化合物，其辛醇水分配系数（logKow）为3.5 ～6.5，易溶于正己烷、丙酮、二氯甲烷、苯等非极性或中等极性溶剂，现有提取法常采用正己烷、丙酮或二氯甲烷等作为提取剂。本文考察了正己烷、环己烷、乙腈、乙腈：丙酮（1+1）、正己烷：丙酮（1+1）对混养鱼配合饲料中多环芳烃的提取效果， 回收率实验结果见表1。 结果表明，正己烷作为提取溶剂，安全、经济且平均回收率较高，因此选择正己烷作为提取溶剂。

表1 不同溶剂对多环芳烃的提取效果（回收率）%

2.2 提取方式的选择 准确称取5.0 g 混养鱼配合饲料样品于50 mL 离心管中， 加入等量的内标、提取溶剂和多环芳烃混合标准溶液，分别选择超声10、20、30 min 和振荡30 min，按照上述方法和条件测定，考察不同提取方式的回收率，结果见图1。超声20 min 和超声30 min 回收率较高，因超声20 min 时间较短，效率较高。故选择超声20 min为提取方式。

图1 不同提取方式对回收率的影响

2.3 净化方法的选择 采用超声20 min 的提取液， 以不同型号固相萃取小柱和全自动凝胶渗透色谱仪（GPC）进行净化，混养鱼配合饲料加标回收实验考察净化结果见图2。 硅胶柱和凝胶渗透色谱（GPC）法的回收率都比较好，但由于水产饲料基质非常复杂， 水产饲料样品中的和脂溶性色素含量较高，很容易超过硅胶柱的净化负荷，总体净化效果略低于凝胶渗透色谱（GPC）法，故选择凝胶渗透色谱（GPC）法作为饲料中多环芳烃测定的净化方法。

图2 净化方法对回收率的影响

2.4 色谱质谱条件的选择和优化 比较了三种程序升温条件下16 种多环芳烃的分离效果，升温程序见表2 ～4，3 种升温条件均能有效分离目标化合物，升温程序3 在满足目标物分离的前提下，时间最短，且升温程序最简单，因此选择升温条件为升温程序3， 升温程序3 目标化合物总离子流图见图3。 目标化合物的保留时间和特征离子见表5。

表2 程序升温条件1

表3 程序升温条件2

表4 程序升温条件3

图3 16 种多环芳烃和同位素内标物的总离子流图

2.5 线性范围、检出限和定量限 配制2、5、10、50、100、500、1000 ng/mL 的多环芳烃混合标准工作溶液，在上述色谱质谱条件下分析测定。以各多环芳烃标准溶液与内标物的质量浓度比为横坐标（x），相对应的标准溶液与内标物峰面积比为纵坐标（y），进行线性回归，以3 倍信噪比估算仪器检出限（LOD），10倍信噪比计算定量限（LOQ），结果见表6。

表5 16 种多环芳烃的参考保留时间及特征离子

表6 16 种多环芳烃回归方程、相关系数（r2）、检出限及定量限

表7 不同饲料样品的加标回收率 %

2.6 方法的准确度和精密度考察 本方法考察了16 种多环芳烃在草鱼育成配合饲料、 小龙虾膨化配合饲料、南美白对虾配合饲料和石斑鱼膨化配合饲料中的添加回收实验。 采用标准添加法，在样品中添加2.0、5.0、20.0 μg/kg 3 个浓度梯度的16 种多环芳烃进行回收率和精密度实验，每次各浓度完成4 个样品3 平行试验，并重复3 次，计算回收率和批内、批间相对标准偏差，计算结果见表7。

2.7 实际样品测定 采用本方法对草鱼育成配合饲料、小龙虾膨化配合饲料、南美白对虾配合饲料和石斑鱼膨化配合饲料等实际样品中16 种多环芳烃进行测定，所有样品均有检出，检测结果见表8。

3 结论

本文采用正己烷超声提取、 全自动凝胶色谱仪（GPC）净化、GC-MS 同位素内标法定量，建立一种水产饲料中16 种多环芳烃残留量的定性定量测定方法，在2.0、5.0、20.0 μg/kg 添加水平下平均回收率分别为81.5% ～99.3%、80.2% ～97.4%、83.1% ～99.8%，所建立的方法定量准确、灵敏度高、重复性好，具有较强的复杂基质抗干扰能力，各项技术指标均能满足日常批次水产饲料样品分析检测要求， 为水产饲料质量安全控制提供了可靠的检测方法依据。

表8 饲料实际品测定结果 μg/kg