脑出血患者外周血microRNA-7表达的变化及其与近期预后的关系

陈培培，张世瑶，付强，李莉

（新疆医科大学第一附属医院1.临床营养科，2.神经外科中心一病区，新疆 乌鲁木齐830011）

脑出血是临床上常见的脑血管疾病，起病快、病情发展迅速，具有较高的致残率和致死率[1]。临床中，在脑出血发病早期判断神经功能的预后、筛选预后不良的高危因素并进行针对性处理对降低脑出血的致残率、改善脑出血的预后具有积极价值。脑出血后神经功能损害的机制复杂，炎症反应及氧化应激反应激活、脑水肿、颅内压升高、胶质细胞活化等均与脑出血后神经功能的损害有关，其中星形胶质细胞的活化能够产生自由基、炎症因子等并介导神经功能损害[2-4]。钱红等[5]的实验表明，在脑出血大鼠模型中增加microRNA-7（miR-7）的表达能够减轻脑组织病理损害、抑制星形胶质细胞活化，提示miR-7 在脑出血中起保护作用，增加miR-7 的表达可能成为改善脑出血患者预后的治疗靶点，但miR-7 在脑出血患者中的变化及意义均未见报道。本研究以脑出血患者为研究对象，具体分析外周血miR-7 表达的变化及其与近期预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015年3月—2019年3月新疆医科大学第一附属医院收治的65 例自发性脑出血患者作为脑出血组。纳入标准：①经头颅CT 证实脑出血；②发病至入院时间＜6 h；③入院时无昏迷症状；④临床资料及随访资料完整。排除标准：①继发性脑出血；②既往有脑外伤、脑出血、脑梗死病史；③合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病、急慢性感染；④近2 周使用过抗生素、免疫制剂的患者。另取同期在该院体检的55 例健康志愿者作为对照组。脑出血组中男性36 例，女性29 例；年龄39～62 岁，平均（48.59±9.29）岁。对照组中男性32 例，女性23 例；平均年龄（47.83±9.83）岁。两组的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 短期预后的评估出院后第90 天时通过门诊或电话回访，采用改良Rankin 量表（mRS）对脑出血组患者的短期预后进行评估，mRS 评分＜3 分为预后良好，mRS 评分≥3 分为预后不良，死亡患者计入预后不良。

1.2.2 外周血miR-7表达的检测于入院时采集脑出血组和体检时采集对照组的外周血3～5 ml 进行miRNA的提取及检测，试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。按照miRNA提取分离试剂盒说明书操作，提取外周血中的miRNA；按照miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书步骤将外周血中miRNA 逆转录为cDNA；按照miRNA荧光定量检测试剂盒说明书配置荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）体系：cDNA 2 μl、反应预混液10 μl、正向引物（10 μmol/L）0.6 μl、通用反向引物（10 μmol/L）0.6 μl、去离子水6.8 μl，在PCR仪上进行扩增反应，扩增程序为95℃预变性3 min、95℃变性5 s、60℃退火延伸15 s、40 个循环。分别扩增目的基因miR-7的引物序列（正向：5'-TAGCGA TTATGCATGCTAA-3'，反向：5'-CTCAACTGGTGTCGT GGA-3'）及内参基因U6 的引物序列（正向：5'-ATTAT GCGCATGCTATATCG-3'，反向：5'-TACTTAGCGTAG AGCTAGCT-3'）。扩增完成后得到循环曲线及循环阈值（Ct），以U6为内参，2-△△Ct法计算miR-7的相对表达量。

1.2.3 临床资料包括脑出血组患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史，入院时的白细胞计数、随机血糖和高敏感C 反应蛋白（hs-CRP）水平、初始血肿体积、出血破入脑室情况及治疗过程中早期肠内营养情况。白细胞计数采用血常规仪检测，hs-CRP 采用全自动生化分析仪检测，初始血肿体积根据头颅CT 检查结果测量，出血破入脑室根据头颅CT 检查判断，早期肠内营养指发病后24～48 h 内给予肠内营养乳剂。

1.3 统计学方法

数据处理采用SPSS 21.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较使用χ2检验。影响因素的分析采用Logistic 回归模型，预测价值采用ROC 曲线分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血miR-7相对表达量的比较

脑出血组外周血miR-7 的相对表达量为（0.57±0.18），对照组外周血miR-7 的相对表达量为（0.89±0.24），两组比较，差异有统计学意义（t=8.333，P=0.000），脑出血组降低。

2.2 脑出血组中预后良好患者与预后不良患者外周血miR-7相对表达量及临床资料的比较

经mRS评分后，脑出血组中预后良好患者为40例，预后不良患者为25 例。预后良好患者和预后不良患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史、白细胞计数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；预后良好患者与预后不良患者的入院时GCS评分、外周血miR-7 的相对表达量、早期肠内营养、随机血糖、hs-CRP、初始血肿体积、出血破入脑室比较，差异有统计学意义（P＜0.05），预后不良患者的入院时GCS 评分、外周血miR-7 的相对表达量降低，早期肠内营养患者减少，随机血糖、hs-CRP 水平升高，初始血肿体积增大，出血破入脑室患者增多。见表1。

表1 脑出血组中预后良好患者与预后不良患者外周血miR-7表达水平及临床资料的比较

2.3 预后不良相关因素的Logistic回归分析

以脑出血患者预后为因变量，以单因素分析有统计学意义的因素（入院时GCS 评分、miR-7 相对表达量、随机血糖、hs-CRP、初始血肿体积、出血破入脑室、早期肠内营养）为自变量，进行一般多因素Logistic 回归分析（α入=0.05），结果显示：miR-7相对表达量减少[=0.692（95% CI：0.501，0.839），P=0.008]、随机血糖[=1.374（95% CI：1.147，2.149），P=0.014]、hs-CRP 升高[=1.294（95% CI：1.039，2.349），P=0.019]是预后不良的危险因素，早期肠内营养[=0.809（95% CI：0.601，0.918），P=0.012]是预后不良的保护因素。见表2。

表2 脑出血患者预后不良相关因素的Logistic回归分析参数

2.4 外周血miR-7 预测脑出血患者预后不良的ROC曲线分析

经ROC 曲线分析，外周血miR-7 预测脑出血患者预后不良的曲线下面积为0.713（P=0.002）；根据约登指数最大值确定外周血miR-7 预测脑出血患者预后不良的最佳截点为0.600，该截点的敏感性为80.00%（95% CI：0.593，0.932），特异性为51.67%（95%CI：0.384，0.648）。见图1。

图1 外周血miR-7预测脑出血患者预后不良的ROC曲线

3 讨论

脑出血后神经功能的损害涉及复杂的病理生理机制，可能的机制包括炎症反应及氧化应激反应激活、脑水肿、颅内压升高、星形胶质细胞活化等[6-9]。近年来，越来越多的研究开始关注脑出血患者预后的相关因素[10-12]，阐明影响脑出血预后的因素不仅能够早期筛查可能出现预后不良的高危患者，还能够根据相关因素制订治疗策略、发现新的靶向治疗手段，有助于为改善脑出血患者的预后提供理论依据。

金子凡[13]的研究共纳入177例脑出血患者，根据出院后90 d 时的mRS 评分判断预后，预后不良患者共68 例（38.42%）。本研究纳入65 例自发性脑出血患者，预后不良患者共25例（38.46%），预后不良的发生情况与金子凡的研究一致。王星辰[14]的研究发现，随机血糖是急性脑出血患者早期神经恶化的独立危险因素；金子凡[13]的研究发现，中性粒细胞与淋巴细胞比值升高与脑出血患者短期预后不良有关；邱斌[15]的研究将早期肠内营养用于重症脑出血患者后发现，患者的神经功能得到改善。本研究预后不良患者与预后良好患者临床资料的比较及Logistic 回归分析可知，随机血糖、hs-CRP 升高是预后不良的危险因素，早期肠内营养是预后不良的保护因素。随机血糖的分析结果与王星辰[14]的研究一致；hs-CRP 是炎症及应激反应标志物，与中性粒细胞与淋巴细胞比值反映炎症及应激的意义相似，分析结果与金子凡[13]的研究一致；早期肠内营养对短期预后的保护作用与邱斌[15]的研究一致。

近年来多项基础研究证实miRNA 在脑出血大鼠中发挥保护作用[16-22]，其中miR-7能够抑制星形胶质细胞、小胶质细胞的活化并减轻脑出血大鼠的神经损害。另有脑梗死的动物实验表明，miR-7在脑梗死大鼠中的表达明显减少[23]。本研究脑出血组外周血miR-7的相对表达量低于对照组，与miR-7的神经保护作用吻合，提示miR-7的低表达可能使其神经保护作用削弱、继而参与脑出血的发生及发展。钱红[5]和ZHANG[24]的研究发现，miR-7在脑出血过程中发挥的保护作用与靶向EGFR/STAT3 及TLR4 通路有关，今后可检测脑出血发病过程中上述通路分子在血清中的变化及与miR-7的相关性来验证miR-7发挥保护作用的分子机制。进一步分析miR-7与脑出血患者短期预后的关系可知，预后不良患者外周血miR-7的相对表达量低于预后良好患者且miR-7相对表达量减少是预后不良的危险因素，说明miR-7相对表达量减少与脑出血患者预后不良有关，增加miR-7的表达可能是治疗脑出血、改善脑出血预后的潜在靶点。此外，本研究还通过ROC 曲线分析了miR-7 对脑出血患者近期预后的预测价值，miR-7预测近期预后的最佳截点值为0.600，敏感性和特异性分别为80.00%和51.67%。

综上所述，脑出血患者外周血miR-7 相对表达量减少且是短期预后不良的危险因素，对短期预后不良具有预测价值，未来miR-7 可能成为治疗脑出血、改善脑出血预后的靶点之一。