MicroRNA-27a通过靶向HBx mRNA抑制HBV复制

代晓朋，宋 兵，牛霄英，盖丽娜，张 丽，焦艳梅，傅占江，崔 澂

HBV感染是一个全球性的公共健康问题，全世界有超过2.5亿HBV携带者，每年约有78万人死于HBV相关性肝病[1-2]。HBV感染可引起免疫介导的肝损伤和癌变，最终导致肝细胞癌[3]。尽管目前存在有效的疫苗和基于干扰素和核苷酸/核苷类似物的治疗策略，但彻底清除患者体内的HBV仍然是一个巨大挑战[4-5]。因此，深入研究HBV复制和表达的调控机制，寻找新的有效抑制HBV感染和复制的靶点，有助于制定更好的治疗策略来实现对HBV的控制。

微小 RNAs（microRNAs,miRNAs）是一类由19～25个核苷酸组成的单链非编码RNA分子，miRNAs可以通过与靶基因的3′ -非翻译区（untranslated region,UTR）完全互补或不完全互补结合，在转录后水平通过降解靶mRNA或抑制mRNA翻译调控靶基因表达[6]。MiRNAs不仅参与了细胞的生长、发育、分化和内环境稳态等多种生物学过程，而且参与复杂的宿主-病毒相互作用和病毒生命周期调控[7]。在病毒性肝炎等多种疾病中miRNAs表达异常，研究表明，miRNAs能调控HBV和HCV等病毒复制[8-10]。因此，对miRNAs的深入研究不仅有助于了解疾病发生的机制，也有助于开发新型的治疗癌症和病毒感染药物。

研究表明，miR-1231、miR-101、miR-581和miR-199a-5p等miRNAs参与调控HBV复制[11-14]。miRNAs参与癌症的发展和纤维化的形成，提示它们在控制乙型肝炎（乙肝）相关的肝脏病理损伤（如肝细胞癌和肝纤维化）方面具有潜在的治疗优势[15-16]。但是，绝大多数miRNAs在HBV复制中的作用仍不明确，寻找新的调控HBV复制的miRNAs，深入研究miRNAs在病毒-宿主中的相互作用，对于制定新的更有效的控制病毒感染和抗病毒治疗的策略具有十分重要的意义。

MiR-27a在肝脏中表达丰富，有研究表明，肝癌患者血循环中miR-27a的表达水平较健康者、慢性乙肝患者以及肝硬化患者降低[17]。HBV相关肝癌组织中miR-27a较其癌旁组织表达增加，且过表达miR-27a可以促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，缩短细胞的周期[18]。另外，分离HBV感染者血液中的HBsAg颗粒，可以检测到HBsAg携带的包括miR-27a在内的多个miRNAs，这些miRNAs可能与病毒的分布、持续感染和致病有关[19]。上述研究结果提示，miR-27a可能在HBV-宿主相互作用中发挥重要的作用。

本研究首先检测了miR-27a在HBV稳定表达细胞系HepG2.2.15和对照细胞系HepG2中的表达差异。然后，运用生物信息学和功能实验方法，阐明了miR-27a在调节HBV复制和表达中的作用及潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 腺病毒Ad-HBx、pcDNA3.1-HBx等HBV蛋白表达载体由本研究室留存。MiR-27a mimics、miR-27a inhibitor及其无关阴性对照（negative control,NC）由 GenePharma Co.Ltd.（中国上海）合成；HBsAg诊断试剂盒、HBeAg检测试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司；HBsAg测定试剂盒（化学发光法）、HBeAg测定试剂盒（化学发光法）购自北京中同兰博医学检验实验室有限公司；HBV核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自凯杰生物工程（深圳）有限公司；GoScript Reverse Transcription System反转录试剂盒、Go Taq qPCR Master Mix定量检测试剂盒购自Promega公司。连接酶、pMD-18T载体等基因克隆及表达相关试剂购自北京全式金生物技术有限公司；HBXIP 抗体（H-5）购自圣克鲁斯生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 肝癌细胞系HepG2、Huh7由本实验室留存，培养条件为含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM培养基。HepG2.2.15（由HepG2细胞系稳定转染1.3倍全长HBV获得）由本实验室留存，培养条件为含380 μg/ml G418的RPMI 1640培养基。细胞均在37 ℃含5% CO2的恒温孵箱中进行培养，并根据细胞生长情况及时换液。

将HBx全长序列克隆pcDNA3.1质粒中，构建重组pcDNA3.1-HBx表达载体；将HBx 3′ UTR的基因序列克隆到报告基因质粒pGL3中，构建重组 pGL3-HBx 3′ UTR；构建 HBx 3′ UTR 靶位点突变报告基因检测载体pGL3-HBx 3′ UTR-Mutant。克隆构建、靶位点突变等相关引物见表1。

表1 引物和序列Table 1 Primers and sequences

提前24 h将要转染的细胞用胰酶消化，计数后铺6孔板（5×106个/孔）或 12 孔板（5×105个/孔）（转染时每组3个重复），16～18 h后待细胞生长到90%～95%融合度用Lipofectamine 2000进行转染。mRNA和蛋白质检测于72 h后收集细胞，荧光素酶报告基因检测于48 h后收集细胞。

1.2.2 实时定量PCR（quantitative real-time PCR,qRTPCR）检测miRNA、mRNA和HBV DNA 细胞培养24 h后，首先按照 TRIzol Reagent（invitrogen）说明书提取细胞内总RNA，检测基因表达水平。根据GoScript Reverse Transcription System反转录试剂盒说明书，取1 μg总RNA反转录为cDNA，反转录反应条件为：16 ℃退火30 min，42 ℃反应30 min，85 ℃反应5 min。然后根据Go Taq qPCR Master Mix定量检测试剂盒说明书，取2 μl反转录的cDNA，分别以U6 snRNA和β-actin为miRNAs和HBV mRNA检测内参，检测miR-27a、HBV mRNA相对表达水平（反转录及定量检测引物见表1）。反应条件为：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s共40个循环；熔解曲线。用2-△△Ct法计算相对表达量[20]。HBV DNA检测按照HBV核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书进行。

1.2.3 ELISA检测HBsAg、HBeAg吸光度及浓度 吸光度检测根据HBsAg诊断试剂盒、HBeAg检测试剂盒说明书进行；浓度检测根据HBsAg测定试剂盒（化学发光法）、HBeAg测定试剂盒（化学发光法）说明书进行。

1.2.4 Western blot检测HBx蛋白表达 细胞处理：将细胞用PBS清洗，用胰酶消化后收集细胞，加入适量的冰上预冷的裂解液（含蛋白酶抑制剂）置于冰上10～20 min裂解细胞，12 000×g 4 ℃离心5 min去除细胞碎片，取等量样品加5×loading buffer煮沸10 min 后上样。电泳：以初始电压为 60 V的电流强度进行稳流电泳，当样品跑到浓缩胶与分离胶交界处时调为80 V，当目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm左右结束。转膜：使用半干法进行转膜，转膜条件为200 mA，45 min。取出膜并用TBST洗膜液漂洗，在含5%牛奶的封闭液中封闭1 h。将一抗稀释后室温下轻摇孵育1 h，4 ℃静置过夜。一抗孵育结束后用洗膜液洗5次，每次 8 min。根据一抗来源选择合适的二抗，1∶1000稀释，在室温条件下轻摇1 h。二抗孵育结束后用洗膜液洗5次，每次8 min。在暗室中显色。

1.2.5 靶基因预测 使用ViTa（http://vita.mbc.nctu.edu.tw/）预测miR-27a在HBV上的靶位点。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测 将含有miR-27a结合位点的pGL3-HBx 3′ UTR或结合位点突变的pGL3-HBx 3′ UTR-M与miR-27a表达质粒及内参质粒（pRL-TK）按照 Lipofectamine 2000说明书进行转染，48 h后用PBS清洗细胞，加入Passive Lysis Buffer裂解细胞，室温震荡15 min。按照说明书分别加入裂解液检测萤火虫荧光素酶反应强度和内参海肾荧光素酶反应强度。RLU1为萤火虫荧光素酶反应强度，RLU2 为内参海肾荧光素酶反应强度，相对荧光强度为Ratio=RLU1/ RLU2。

1.3 统计学处理 每个实验至少重复3次，用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，正态分布的计量数据用±s表示。2组荧光素酶相对活性、mRNA和miRNAs表达水平的比较采用成组t检验。P＜0.05表明差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MiR-27a过表达对HBV复制和表达的影响 将miR-27a mimics及NC分别转染Huh7细胞，qRT-PCR检测miR-27a表达水平，结果如图1A所示，miR-27a mimics转染细胞后miR-27a表达水平显著升高。进一步探究miR-27a过表达对HBV复制和表达的影响，将miR-27a mimics及NC分别与pHBV1.2组合转染Huh7细胞，qRT-PCR检测miR-27a过表达对HBV DNA和HBV RNA的影响，结果如图1B（HBV DNA）和图1C（HBV RNA）所示，miR-27a表达抑制HBV DNA和HBV RNA，提示miR-27a抑制HBV的复制和转录；ELISA检测miR-27a过表达对HBeAg和HBsAg的影响，吸光度检测结果如图1D（HBeAg）和图1E（HBsAg）所示，浓度检测结果如图1F（HBeAg）和图1G（HBsAg）所示，结果提示miR-27a过表达抑制HBeAg和HBsAg表达，提示miR-27a抑制HBV蛋白表达。以上研究结果表明，在肝癌细胞系Huh7中，miR-27a过表达抑制了HBV复制和表达。

图1 MiR-27a过表达对HBV复制和表达的影响A.MiR-27a mimics及NC转染Huh7细胞，miR-27a相对表达量检测；B～G.MiR-27a mimics及NC分别与pHBV1.2组合转染Huh7细胞，HBV复制和表达相关指标检测，HBV DNA（B）、HBV RNA（C）、HBeAg 吸光度（D）、HBsAg 吸光度（E）、HBeAg 浓度（F）、HBsAg 浓度（G）Figure 1 Effect of miR-27a overexpression on HBV replication and expression

2.2 抑制内源性miR-27a表达对HBV复制和表达的影响 将miR-27a inhibitor及NC转染Huh7细胞，qRT-PCR检测miR-27a表达水平，结果如图2A所示，转染miR-27a inhibitor后miR-27a表达水平显著降低，提示miR-27a inhibitor可有效抑制miR-27a表达。将miR-27a inhibitor及NC分别与pHBV1.2组合转染Huh7细胞，qRTPCR检测抑制内源性miR-27a对HBV DNA和HBV RNA的影响，结果如图2B（HBV DNA）和图2C（HBV RNA）所示，抑制内源性miR-27a使HBV DNA和HBV RNA表达水平升高，提示抑制内源性miR-27a表达能够促进HBV的复制和转录；ELISA检测抑制内源性miR-27a对HBeAg和HBsAg的影响，吸光度检测结果如图2D（HBeAg）和图2E（HBsAg）所示，浓度检测结果如图2F（HBeAg）和图2G（HBsAg）所示，结果显示抑制内源性miR-27a表达促进HBeAg和HBsAg表达，提示miR-27a促进HBV蛋白表达。以上研究结果表明，在肝癌细胞系Huh7中，抑制内源性miR-27a表达促进了HBV复制和表达。

图2 抑制内源性miR-27a表达对HBV复制和表达的影响A.MiR-27a inhibitor及NC转染Huh7细胞，miR-27a相对表达量检测；B～G.MiR-27a inhibitor及NC分别与pHBV1.2组合转染Huh7细胞，HBV复制和表达相关指标检测，HBV DNA（B）、HBV RNA（C）、HBeAg 吸光度（D）、HBsAg 吸光度（E）、HBeAg 浓度（F）、HBsAg 浓度（G）Figure 2 Effect of downregulation of endogenous miR-27a expression on HBV replication and expression

2.3 MiR-27a直接靶向HBx 以上研究发现miR-27a可抑制HBV的复制与表达，进一步分析miR-27a调控HBV复制和表达的分子机制。推测存在两种可能的机制，第一种是miR-27a通过直接靶向HBV RNA而抑制HBV复制和表达；第二种是miR-27a通过靶向HBV复制过程中的调控因子而间接影响HBV复制和表达。通过ViTa在线预测，发现HBx含有miR-27a的靶位点，如图3A所示 。

图3 MiR-27a直接靶向HBxA.MiR-27a与HBx的结合位点及其突变位点；B.MiR-27a mimics/miR-27a inhibitor及其各自的NC分别与miR-27a结合位点的HBx报告基因载体组合转染Huh7细胞，双荧光素酶报告基因检测相对荧光强度；C.MiR-27a mimics及NC分别与miR-27a结合位点突变HBx报告基因载体组合转染Huh7细胞，双荧光素酶报告基因检测相对荧光强度；D～E.MiR-27a mimics及NC分别与HBx表达载体组合转染Huh7细胞，检测HBx RNA（D）和HBx蛋白（E）Figure 3 MiR-27a targets HBx directly

将miR-27a mimics/miR-27a inhibitor及相应的NC分别与pGL3-HBx 3′ UTR-Mutant组合转染Huh7细胞，48 h后收集细胞，检测双萤光素酶活性，结果如图3B所示，miR-27a使含有HBx 3′ UTR的报告基因活性降低。进一步将HBx上miR-27a的结合位点突变（突变位点如图3A所示），构建含有HBx 3′ UTR突变序列的报告基因载体pGL3-HBx 3′ UTR-Mutant，将 miR-27a mimics及其 NC 分 别 与 pGL3-HBx 3′ UTR-Mutant组 合 转染Huh7细胞，48 h后收集细胞，检测双萤光素酶活性，结果如图3C所示，miR-27a表达对含有突变位点的报告基因活性没有显著影响。以上结果提示miR-27a能够直接靶向HBx RNA。进一步构建含有HBx序列的表达载体pcDNA3.1-HBx，探究miR-27a对HBx RNA及蛋白表达的影响，将miR-27a mimics及NC分别与pcDNA3.1组合转染Huh7细胞，72 h后收集细胞，qRT-PCR检测HBx RNA，结果如图3D所示，western blot检测HBx蛋白表达，结果如图3E所示，转染miR-27a能够抑制HBx RNA和蛋白表达。以上结果提示，miR-27a能够直接靶向HBx RNA，从而间接抑制HBV的复制和表达。

2.4 HBV对miR-27a表达的影响 将pHBV1.2及其空载体转染Huh7细胞，72 h后收集细胞，qRT-PCR检测miR-27a表达水平，结果如图4A所示，瞬时转染pHBV1.2使miR-27a的表达水平下降，提示HBV能够抑制miR-27a的表达。与对照细胞HepG2的miR-27a表达水平相比，稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞miR-27a表达水平显著降低，如图4B所示。由于miR-27a能够直接靶向HBx 3′ UTR，本研究将表达HBx的腺病毒（Ad-HBx）感染Huh7细胞，检测HBx的表达对miR-27a的影响，结果如图4C所示，Ad-HBx感染Huh7细胞使miR-27a表达水平下降，提示HBx使miR-27a表达水平降低。

图4 HBV对miR-27a表达的影响A.pHBV1.2及其对照（Ctr）转染Huh7细胞，qRT-PCR检测miR-27a相对表达；B.qRT-PCR检测HepG2和HepG2.2.15细胞miR-27a相对表达；C.Ad-HBx表达载体和空腺病毒Ad感染Huh7细胞，qRT-PCR检测miR-27a相对表达Figure 4 Effect of HBV on miR-27a expression

3 讨 论

HBV感染是导致活动性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等肝脏疾病的主要因素[21]。尽管针对HBV感染的诊断和治疗已经取得了很大的进步，但这并不能从根本上消除HBV感染[22]。因此，亟需寻找和开发新的抗HBV靶点和药物。越来越多的证据表明miRNAs在HBV感染中发挥重要的调控作用。MiR-27a在多种生物学过程中发挥重要作用，包括基因多态性、肿瘤发生、增殖、细胞凋亡、侵袭、迁移和血管生成[23]。在患肝癌的肥胖患者中，miR-27a通过靶向FOXO1促进肝癌细胞的增殖[24]。MiR-27a在肝癌组织和肝癌细胞系中表达上调，通过调节PPAR-γ的表达促进肝癌细胞增殖，并作为癌基因在肝癌细胞中发挥重要作用[25]。然而，miR-27a在HBV感染中的潜在作用和分子机制仍未明确。

本研究发现在HBV感染的肝癌细胞Huh7中miR-27a表达水平显著降低；随着miR-27a表达水平的升高，Huh7细胞中HBV RNA、HBV DNA、HBeAg和HBsAg等HBV复制和基因表达的指标显著降低；抑制内源性miR-27a的表达能够促进HBV的复制和表达。提示miR-27a可能是一种潜在的HBV复制抑制因子。

MiRNAs调控HBV的机制主要分为两类：一类是miRNAs直接靶向作用于HBV的转录本，如 miR-125a-5p、miR-199a-3p、miR-210、miR-1231，其中miR-125a-5p和miR-199a-3p靶位点位于表面蛋白和聚合酶重叠的编码区域，而miR-210的靶位点位于pre-s1编码区域，miR-1231靶向 HBV 核心蛋白 mRNA[12，26]。第二类是通过作用于相关的细胞蛋白影响HBV生命周期，如miR-146a靶向 flap endonuclease 1[27]，miR-802靶向SMARCE1分 子[28]，miR-200c靶 向 nuclear factor IA[29]，miR-302c-3p 靶 向 BMPR2[30]，miR-185-5p 靶向 ELK1分子等[31]。本研究发现miR-27a可以直接靶向HBx 3′ UTR，抑制HBx转录和表达，最终抑制HBV的复制与表达。

研究表明，HBV X蛋白可以引起宿主miRNAs的变化，如：HBx 促进miR-29a和miR-143表达，抑制miR-101、miR-122、miR-132、miR-148a、miR-152、let-7和miR-16家族的成员表达[32]。目前HBV影响miRNA表达的分子机制主要有两种，一种是HBV mRNA通过自身含有的miRNAs互补位点与miRNAs结合，这样细胞内大量的HBV RNA起到海绵体作用从而抑制其miRNAs发挥作用，例如miR-122和miR-15a[33-34]；另一种是转录因子参与HBV对miRNAs的调控，如c-Myc参与HBx对miR-15a/16的抑制作用[35]。本研究表明miR-27a可以直接靶向HBx 3′ UTR，提示在HBV感染中，HBx的转录产物可能作为“海绵体”与miR-27a结合，从而使miR-27a表达水平降低。

本研究尚有不足之处，由于缺乏体内研究，可能会削弱miR-27抑制HBV复制和表达的证据。HBV感染导致miR-27a表达水平下降，但是有研究表明在肝癌中miR-27a的表达水平升高，因此，miR-27a在HBV相关的肝癌中的变化及临床意义须要进一步深入研究。

综上所述，本研究发现miR-27a在HBV感染的Huh7细胞中表达下调；miR-27a通过直接靶向抑制HBx mRNA进而抑制了HBV复制和表达。上述研究结果提示，miR-27a在HBV-宿主的相互作用中发挥重要作用，miR-27a可作为一种潜在的控制病毒感染的治疗靶点。