发酵乳中内源性苯甲酸产生的影响因素

王伟佳,刘爱国*,廖振宇,刘立增,孙丽婷,杨红,刘蕊,刘长旭,李雨轩

1(天津商业大学 生物技术与食品科学学院,天津市食品生物技术重点实验室,天津,300134)2(谱尼测试科技(天津)有限公司,天津,300392)

苯甲酸(benzoic acid)又叫安息香酸,常常在食品中作为防腐剂使用[1]。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[2]中规定了其在各类食品中允许使用的限量要求,如在食品中超范围或超限量使用会对人体肝脏产生危害,甚至致癌。但在日常检验过程中发现，部分食品中天然存在苯甲酸,因此,内源性的苯甲酸为食品的日常监管检验产生一定的困扰。孙屏等[3]研究发现，新疆红枣中天然苯甲酸平均值为84 mg/kg；张青云等[4]报道了蜂蜜中含有不超过15 mg/kg的苯甲酸；SIEBER等[5]的研究发酵乳的苯甲酸含量能达到50 mg/kg。一般来说,内源性苯甲酸产生有以下3种途径[6-8]:马尿酸水解、苯丙氨酸代谢、苯甲醛氧化。国家标准中规定发酵乳中不允许使用苯甲酸[2],但在实际检测中,由于原料乳在乳酸菌的作用下,马尿酸脱甘氨酸产生苯甲酸[9],因而发酵乳中经常被检出苯甲酸天然残留。随着消费者越来越关心饮食安全,为降低发酵乳中内源性苯甲酸的含量,保障百姓尤其儿童身体健康[10],本论文通过研究不同浓度的全脂乳粉、发酵温度、时间、pH、乳酸菌种类对发酵乳中苯甲酸产生的影响,初步探究发酵乳中苯甲酸产生的规律,为乳品质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

全脂乳粉,新西兰恒天然集团；白砂糖,广西上上糖业有限公司；嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌,普尔斯(天津)国际贸易有限公司；发酵乳,超市。

马尿酸标准品、苯甲酸标准品,中国计量科学研究院；甲醇(色谱纯),美国Hipure Chem 公司；乙酸锌(分析纯),天津市福晨化学试剂厂；亚铁氰化钾(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、硫酸(优级纯)、冰乙酸(分析纯),天津市风船化学试剂科技有限公司；乳酸(分析纯),北京纯奇商贸有限责任公司；碳酸氢钠(分析纯),天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.1.2 仪器设备

Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪、CNW C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),日本Shimadzu公司；WTL-4K离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-800DE超声仪,昆山市超声仪器有限公司；PHS-3C型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵乳的制备

水预热(50 ℃)→复原乳[10%全脂乳粉，6%白砂糖，均为质量分数(下同)]→杀菌(85 ℃,20 min)→冷却降温(40 ℃)→接入发酵剂(0.04%嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌混合发酵剂)→搅拌(10 min)→ 保温发酵(42 ℃,5 h)→冷藏保存(4 ℃)[11]

1.2.2 样品前处理

称取 20 g 样品(精确至 0.01 g)于100 mL 容量瓶中,加入 25 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,混合后置于超声波水浴或 70 ℃水浴中处理15 min。冷却后,用 0.5 mol/L H2SO4溶液调pH到8,分别加入 2 mL 92 g/L亚铁氰化钾溶液和183 g/L 乙酸锌溶液。剧烈振摇,静置 15 min,混合后冷却到室温,甲醇定容,静置 15 min,4 000 r/min 离心,上清液经 0.22 μm 滤膜过滤。收集滤液,用于高效液相色谱仪测定样品中马尿酸和苯甲酸含量[12]。

1.2.3 全脂乳粉添加量的确定

分别以6%、8%、10%、12%、14%的全脂乳粉添加量进行发酵乳制作。

1.2.4 发酵初始酸度确定

按照1.2.1小节的方法进行发酵乳制备,在发酵前分别用乳酸调节复原乳pH至3、4、5和6,用碳酸氢钠溶液调节pH至7,然后进行发酵。

1.2.5 发酵温度确定

按照1.2.1小节的方法制备发酵乳,分别控制发酵温度为25、35、42、45和50 ℃。

1.2.6 发酵时间控制

按照1.2.1小节制备发酵乳,每隔1 h进行发酵乳的采集,直至发酵6 h。

1.2.7 乳酸菌种类控制

按照1.2.1小节制备发酵乳,改变发酵剂类型,分别以嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌作为发酵剂进行发酵。

1.2.8 色谱条件

高效液相色谱柱温箱柱温为40 ℃,进样量10 μL,以0.4%乙酸和甲醇为流动相,流速1 μL/mL,进行等度洗脱,检测波长为240 nm。

1.2.9 数据分析

全部数据用SPSS 23.0分析,采用Origin 9.5 以及Office 2019绘制图表。

2 结果与讨论

2.1 苯甲酸与马尿酸HPLC方法验证

2.1.1 线性范围、线性方程以及检出限

配制质量浓度为0、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL的马尿酸和苯甲酸标准溶液,上机检测,10 μg/mL标准溶液谱图如图1所示。结果表明,在0～20 μg/mL质量浓度范围内有着比较好的线性关系,马尿酸和苯甲酸的相关系数分别为0.999 8和0.999 7,线性方程、线性范围、相关系数、检出限[13](3 S/N)、定量限[13](10 S/N)如表1所示。发酵乳样品色谱图见图2。由实验结果可知该方法对马尿酸和苯甲酸有着较高的分离度,且灵敏度好。

表1 马尿酸与苯甲酸检测的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 1 Linear equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification limit for hippuric acid and benzoic acid

图1 不同浓度马尿酸、苯甲酸标准品液相色谱图Fig.1 Liquid chromatograms of different concentrations of hippuric acid and benzoic acid standards

图2 发酵乳样品液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of fermented milk sample

2.1.2 回收率和精密度

取发酵乳样品,分别对其做1、5和10 μg/mL的加标回收实验(表2),样品按照1.2.2和1.2.3小节的方法进行处理。马尿酸和苯甲酸的回收率分别为97.46%、98.67%。

表2 发酵乳样品马尿酸与苯甲酸的回收率Table 2 Recovery of hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

选取一个发酵乳样品,进行7次平行实验,测定相应的峰面积(表3)。结果表明,马尿酸与苯甲酸的RSD分别为0.405%和1.298%,均小于15%,该方法有较好的重复性和准确性[14]。

表3 发酵乳样品马尿酸与苯甲酸的精密度测定Table 3 Repeatability analysis of hippuric acid and benzoic acid in yogurt

2.2 发酵乳中苯甲酸产生的影响因素

2.2.1 全脂乳粉含量的影响

分别添加6%、8%、10%、12%、14%的全脂乳粉,0.02%嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌混合发酵剂,发酵温度40 ℃,发酵6 h制备发酵乳。测定发酵完成的样品中马尿酸和苯甲酸含量,结果如图3所示。

图3 不同全脂乳粉浓度发酵乳中马尿酸和苯甲酸含量Fig.3 Contents of hippuric acid and benzoic acid in fermented milk with different whole milk powder concentration

随着乳粉含量的增加,发酵乳中马尿酸的含量也相应提高。全脂乳粉在6%～14%的范围内,发酵前发酵乳中马尿酸含量为23.732～55.667 μg/mL,发酵后马尿酸含量明显降低,其范围在20.402～35.997 μg/mL;苯甲酸在全脂乳粉含量为14%的发酵乳中含量最高,为(12.078±0.135)μg/mL。结果表明发酵乳中苯甲酸的含量与原料乳中马尿酸水平呈正相关。

2.2.2 发酵初始酸度的影响

发酵乳发酵前加入乳酸调节pH(3～7),观察初始pH对发酵乳中苯甲酸产生的影响。发酵条件与1.2.1小节一致,实验结果如图4所示。在发酵过程中,当初始pH<6时,随着pH值的升高,苯甲酸的含量逐渐递增,同时,马尿酸的含量逐步降低。当pH值>6时,发酵乳中苯甲酸含量呈下降趋势。乳酸菌最适生长pH为5.5～6.5[15-17],当初始pH<4时,样品中马尿酸转化成苯甲酸的能力较弱,苯甲酸含量较低。

图4 不同pH对发酵乳中马尿酸和苯甲酸的影响Fig.4 Effects of different pH on hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

2.2.3 发酵温度的影响

观察在25、35、40、45、50 ℃下发酵乳中马尿酸和苯甲酸的变化规律。40 ℃下,苯甲酸含量达到最高值,为(10.448±0.576)μg/mL。高于40 ℃时,苯甲酸含量随着发酵温度的升高,呈下降趋势(图5)。

图5 发酵温度对发酵乳中马尿酸和苯甲酸的影响Fig.5 Effects of temperature on hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

文献表明苯甲酸产生的最佳温度分别为40 ℃以及38.12 ℃[18-19],与本实验结果较为一致。当发酵温度为40 ℃时,乳酸菌处于最佳的代谢温度,代谢强度也达到较高的水平,从而促进了马尿酸的水解,产生更多的苯甲酸。

2.2.4 发酵时间的影响

在发酵过程中,每隔1 h取1次样品,进行发酵乳中马尿酸和苯甲酸检测,观察在发酵过程中马尿酸和苯甲酸的转化规律。随着发酵时间的延长,苯甲酸含量呈现上升趋势,马尿酸含量与之相反,且在2～4 h内苯甲酸含量增加较快(图6),之后趋于平缓。SIGITA等[20]报道乳酸菌处于生长对数期时,马尿酸转化苯甲酸的速度较快。

图6 发酵过程中苯马尿酸和苯甲酸的变化Fig.6 Changes of benzoic acid and benzoic acid during fermentation

2.2.5 乳酸菌种类的影响

以不同的乳酸菌作为发酵剂制备发酵乳,比较不同菌种之间产生苯甲酸的差异。在选取的5种发酵剂中双歧杆菌产生的苯甲酸含量最低(0.238 μg/mL),以鼠李糖乳杆菌作为发酵剂的样品中苯甲酸含量最高(10.355 μg/mL)。作为发酵乳中常用的保加利亚乳杆菌,也产生较高浓度的苯甲酸(图7)。

图7 发酵乳中不同发酵剂对苯甲酸含量的影响Fig.7 Effects of different starter on benzoic acid content in fermented milk

在YU等[19]的研究中,当发酵24 h时,鼠李糖乳杆菌发酵的发酵乳苯甲酸含量为13.89 μg/mL,由双歧杆菌产生的苯甲酸为1.43 μg/mL。实验结果表明,发酵乳中苯甲酸的产生受到发酵剂类型的影响。

2.3 市售发酵乳中苯甲酸含量的检测

从超市购买12个不同品牌的发酵乳,分析不同发酵乳中苯甲酸之间的含量差异,结果见表4所示。所有样品中均有苯甲酸的检出,含量范围为0.73～7.373 μg/mL,平均值为2.692 μg/mL,与谭连英等[21]报道的保质期内发酵乳的苯甲酸含量接近。市售酸奶中不同品牌间苯甲酸存在差异(P<0.05),分析其原因:一是不同品牌的发酵乳配料及含量存在差异,尤其是原料乳方面；二是不同厂家使用的发酵剂的类型不一,不同乳酸菌之间产苯甲酸能力不同；三是不同发酵乳之间的发酵时间存在差异。

表4 不同市售发酵乳中马尿酸和苯甲酸含量差异Table 4 Difference of hippuric and benzoic acid contents in various market fermented milk

3 结论

通过研究不同含量的全脂乳粉、发酵温度、发酵时间、pH、乳酸菌种类5个因素，了解发酵乳中苯甲酸产生的影响因素。结果表明,所有发酵乳中均有苯甲酸的检出,以上5个因素对发酵乳中苯甲酸产生均有一定的影响。在不同含量的全脂乳粉中,发酵乳中苯甲酸的含量与原料乳中马尿酸水平呈正相关；在发酵过程中,当初始pH<6时,随着pH值的升高,苯甲酸的产生逐渐递增；在发酵温度40 ℃下,产生苯甲酸的含量达到最高值；乳酸菌处于生长对数期时,马尿酸转化苯甲酸的速度较快；在选取的5种不同发酵剂中,双歧杆菌产生的苯甲酸含量最低。本研究为发酵乳中苯甲酸的监管检验提供了科学参考。