姜黄素减缓老年小鼠的骨丢失

陈玉凤,李 晶,张 东,曹 勇,赵祥龙,谢亦璘,陆继红,任一萍,乔之光,乔中东

(1.上海交通大学 生命科学技术学院,上海 200240; 2.如新(中国)日用品保健品有限公司 抗衰老科研中心,上海 201401; 3.上海交通大学医学院附属仁济医院南院 骨科,上海 201112)

骨质疏松症是一种骨量丢失、骨骼强度下降,骨组织微结构遭到破坏导致骨脆性增加从而引发骨折风险性提升的全身性骨骼系统疾病[1].骨质疏松症多见于绝经后的妇女与老年男性，且在不同种族和族裔群体间存在差异性[2].随着我国人口结构的老龄化,可以预见骨质疏松症及骨折的患病率将显著增加,会带来巨大的健康威胁和经济损失[3].

姜黄素(Curcumin, CMN)是从姜黄属植物根茎中提取的一种天然亲脂小分子[4].姜黄素具有多种药理作用: 抗肿瘤、抗炎、抗HIV、抗菌、抗氧化等[5],具有良好的临床应用潜力;文献表明姜黄素可以防止卵巢切除引起的骨质流失[6],并通过增加破骨细胞自噬来抑制破骨细胞的形成[7];Cheng等发现较高剂量的姜黄素可以治疗糖基化引起的骨质疏松症[8].Riva等证实了给低骨量人服用含有姜黄素的口服剂可以增强小指和上颌骨的骨密度[9],有助于预防和减缓骨质丢失.上述实验为姜黄素治疗老龄化引起的骨质疏松提供实验基础和理论依据.综上所述,CMN是一种能够能促进骨骼形成,又能减少骨骼吸收的天然化合物[10].

雌激素缺乏是骨质疏松发生的主要成因[11],现有研究表明细胞衰老是骨质疏松的成因之一[12-13].小鼠所发生的与年龄相关的骨丢失,呈现出与人类极为相似的特征.文献表明,小鼠3～6月龄相当于人类青壮年(20～30岁),小鼠10～14月龄相当于人类中年(38～47岁),小鼠18～24月龄相当于人类老年(56～69岁)[14].此前,骨质疏松相关研究大部分采用大鼠卵巢切除(Ovariectomy, OVX)模型,但OVX模型大鼠会存在突然和过早的卵巢激素的丢失,在细胞、组织、器官和系统水平上也改变了一些基本的衰老过程[15-17].基于有关CMN对雄性老年小鼠骨质疏松影响的研究尚未见报道,因此,本研究采用老年雄性小鼠作为研究对象,观察CMN是否在老年雄性小鼠中具有抗骨质疏松的作用.

1 材料与方法

1.1 动物处理

从上海交通大学实验动物中心处获取6月龄C57BL/6(上海斯莱克实验动物有限责任公司,2015000531078)小鼠8只,18月龄小鼠16只.关于小鼠的任何实验均遵循上海交通大学伦理委员会颁布的相关规定.每只小鼠都在笼中饲养,饮水和饮食不受限制,温度湿度等生活条件都保持在一致的水平.小鼠在动物房适应1周后,开始进行实验.年轻小鼠在实验开始时处死取材.18月龄小鼠随机挑选8只,在实验开始时处死作为服用CMN等药物前的对照;剩余8只18月龄小鼠作为实验组.用蒸馏水将阿拉伯胶配成质量浓度5%水溶液作为溶剂,药物的浓度是根据小鼠体重决定的.CMN用量是33.3 mg/kg.

对照组每天用含有5%的阿拉伯胶蒸馏水灌胃,3个月后处死取材;实验组根据小鼠体重每天用相同溶剂配置的CMN灌胃,3个月后处死取材.实验开始前及实验进行中每周测量两次小鼠体重.

1.2 小鼠胫骨微观结构测量

实验选用小鼠左右胫骨,利用显微CT(SCANCO Medical AG,瑞士),设定其扫描分辨率为10 μm,电压为70 kV,电流为200 μA,3维重建图像为906×906像素矩阵.采集并分析以下微观结构参数: 骨小梁数目(NTb)、骨体积分数(VB/VT)、骨小梁厚度(dTb)、骨小梁间隙(dTb-Sp)、结构模型指数(ISM)等.

1.3 小鼠胫骨骨组织学观察

将小鼠左右胫骨在质量浓度4%的多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水(PFA/PBS)中固定24 h,用商品化EDTA脱钙液对标本进行脱钙处理,酒精梯度脱水,浸蜡-包埋-切片后,二甲苯脱蜡进行苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,HE)染色,在显微镜(Olympus BX51,瑞士)下观察并采集图像(20倍镜与100倍镜),每张切片选取3个视野观察骨组织骨小梁结构形态,测量骨小梁面积百分数.

1.4 小鼠胫骨微观成分的测量

将取得的胫骨用梯度酒精脱水,浸蜡包埋后,切得5 μm厚的薄片置于直径为2.5 cm氟化钡窗片上.使用二甲苯和无水乙醇脱蜡.利用傅里叶显微成像红外光谱仪(NicoletiN10 MX)测量胫骨微观成分.扫描方式选择面扫,光谱分辨率设定为8 cm-1,测量面积设置根据样品大小框选范围,步长设置为30 μm.扣除氟化钡作为背景对光谱的影响,每个标本采集16个红外光谱.使用NicoletiN10 MX自带的OMNIC8.0软件处理光谱,得到以下参数: (1) 骨矿盐和基质比(mineral to matrix ratio),磷酸盐峰(1 180～920 cm-1)下面积与氨基化合物 Ⅰ (1 720～1 585 cm-1)峰面积比值;(2) 结晶度(crystallinity),1 030 cm-1和1 020 cm-1处子峰高比值;(3) 胶原交联比(collagen cross-link ratio),氨基化合物 Ⅰ 下1 660 cm-1和1 690 cm-1子峰高比值；(4) 碳酸盐取代程度(degree of carbonate substitution),碳酸盐条带855～890 cm-1和磷酸盐条带920～1 180 cm-1峰面积比值[18-19].

1.5 统计分析

本研究所有数据使用Prism6.0软件进行统计分析.本实验所有研究均进行至少3个生物学重复,数值结果均以均值±标准差(mean±SEM)形式表示,组间两两相比较采用LSD-t检验,比较相关参数的差异是否显著.*(P<0.05)表示差异显著,**(P<0.01)表示差异极显著.

2 结 果

2.1 小鼠胫骨MicroCT显示CMN能够减缓老年小鼠松质骨骨量丢失

由图1中可以看出,与6月龄的雄性小鼠相比,18月龄老年雄性小鼠胫骨骨量显著性下降,胫骨的松质骨海绵状结构也愈发疏松,无药物处理21月龄老年小鼠松质骨骨量也明显低于18月龄老年小鼠.图2显示: 18月龄老年小鼠的骨体积分数(VB/VT)、骨小梁数目(NTb)和骨小梁厚度(dTb)3个参数明显低于6月龄年轻小鼠的.随着年龄的继续增长,21月龄老年小鼠相较于18月龄老年小鼠，其骨体积分数、骨小梁数目显著下降,但是骨小梁厚度变化不大.

图1 小鼠胫骨MicroCT扫描结果Fig.1 The result of MicroCT scanning of tibia in mice

由图2可知,18月龄老年小鼠的骨小梁间隔(dTb-Sp)、结构模型指数(ISM)明显大于6月龄年轻小鼠的,更加接近3,其结果存在统计学差异.这说明18月龄老年小鼠发生了明显的骨质疏松,本研究选取的老年小鼠的骨质疏松模型是可行的.无药物处理的21月龄老年小鼠与18月龄老年小鼠的骨小梁间隙也存在着统计学差异,但是它们的结构模型指数相差不大.CMN处理后,老年雄性小鼠骨量尤其是松质骨骨量有明显的提升,胫骨松质骨海绵状结构疏松状况有所改善.老年小鼠的骨体积分数、骨小梁数目和骨小梁厚度有明显的提升(P<0.05)，其骨小梁间隙与结构模型指数则有所降低,但后者不存在统计学差异.

图2 胫骨胫骨显微结构参数Fig.2 Microstructural parameters of tibia in mice

2.2 小鼠胫骨组织学显示CMN能够有效阻止老年小鼠胫骨骨小梁数目减少

由图3可知: 6月龄雄性小鼠骨小梁排列整齐而紧密,连续性较好,宽度均匀,且骨小梁间隙较小,骨小梁数目较多;而18月龄老年小鼠组骨量明显下降,骨小梁变细、数目减少且骨小梁之间连续性较差、游离断端增多、骨小梁间隙增大;到了21月龄,小鼠骨小梁数目进一步降低,间隙进一步加大.6月龄小鼠相对于髓腔的骨小梁面积百分数为50.42%±0.41%,显著高于18月龄老年小鼠(39.23%±2.07%,N=3)(P=0.002 8<0.01),21月龄小鼠骨小梁面积百分数(28.67%±1.19%)也明显低于18月龄小鼠(P=0.011 4<0.05).这个可以进一步说明年轻小鼠的骨量优于老年小鼠,而老年小鼠随着年龄增长骨量会进一步丢失.这一结果与MicroCT结果一致,进一步从组织学角度阐述了老年小鼠伴随着年龄增大会存在相关性的骨丢失.

图3 小鼠胫骨组织学结果Fig.3 Histological results of tibia in mice

CMN灌胃老年小鼠3个月后,与对照组相比,骨小梁面积百分数由28.67%±1.19%增加到32.90%±0.90%(P=0.046 8<0.05),且间隙有所减小,断裂和散乱程度有所降低.

2.3 CMN可以通过改变老年小鼠胫骨微观成分增强骨强度

傅里叶显微红外结果显示,18月龄老年小鼠矿物质基质的比值(P=0.004 3)与碳酸盐取代程度较6月龄小鼠显著降低(P=0.018 4),而胶原交联比(P=0.001 1)和结晶度显著增加(P=0.009 2).21月龄老年小鼠与18月龄老年小鼠相比,也存在着同样的趋势(图4).这从微观成分角度揭示了骨质疏松发生时,骨组织微观成分的改变,解释了骨强度下降骨脆性增加的部分成因.由图4中可以发现,与未处理的21月龄老年小鼠相比,实验组老年小鼠矿物质基质比和碳酸盐取代程度有所增加,胶原交联比和结晶度略有下降,统计结果均存在显著性差异.进一步说明CMN可以从微观成分的改变来逆转老年相关性的骨丢失.

图4 小鼠胫骨骨组织微观成分结果Fig.4 The results of microelements of tibial bone tissue in mice

3 讨 论

本研究发现雄性老年小鼠骨量比年轻小鼠明显降低,表现出明显的骨质疏松症状,且随着年龄进一步的增加,雄性老年小鼠会继续发生骨丢失.在本研究中通过CMN干预后,雄性老年小鼠胫骨骨质疏松症状得到明显改善.

显微CT可以很好地观察骨的微观结构,且有较好的准确性与重建性[20].HE组织学染色,能够在组织学角度上对显微CT的结果进行佐证.传统红外光谱学可以研究骨组织矿化过程中羟基磷灰石的信息,譬如碳酸盐的存在,但它局限于均匀骨质.显微红外可以较好地研究不均匀骨质,且其空间分辨率较高,可以较好地了解矿物和基质成分的空间变化,进而解释骨组织机械性能的变化.因而显微红外适用于骨这种不均匀、异质性的组织,并判定它的空间含量结构与成分的差异[19].

有学者发现姜黄素可以缓解OVX模型引起的骨质疏松,其机制与它的3个功能(对细胞膜功能和结构的改变、抗炎作用、抗氧化作用)相关.姜黄素作为一种亲脂小分子,可以迅速渗透到细胞膜,从而破坏细胞膜的完整性,也会影响到细胞膜上附着的受体蛋白等.例如,姜黄素通过改变磷脂酰亚胺的通路调节蛋白激酶C的活性[21].它也会影响NF-κB,而NF-κB在参与炎症疾病和炎症反应的信号转导通路起着重要作用[22].另外姜黄素会下调环氧合酶2的表达,抑制促炎酶5-LOX的表达[23-24].姜黄素可以增加磷酸化蛋白激酶B和糖原磷酸化合成酶kinase-3β(GSK3β)的表达水平,即它能激活Akt-GSK3β信号.也有文献报道,姜黄素通过抑制MMP-9激活的microRNA-365改善糖皮质激素诱导的继发性骨质疏松小鼠的骨微结构[25].

我们的研究发现骨质疏松的发病机制与雄性激素低下相关,与年龄相关的睾酮缺乏是老年男性骨质流失的最重要因素.雄激素可以通过直接与雄激素受体结合或通过雌激素芳构化间接与雌激素受体结合来影响骨骼健康[26-27].而姜黄素缓解雄性老年小鼠骨质疏松可能与之相关.

综上所述,CMN能够通过增加雄性老年小鼠胫骨组织,增加骨体积分数、骨小梁数目、增大骨小梁面积百分比,并减小骨小梁间距.目前没有关于CMN对老年雄性小鼠骨组织作用的研究,本研究所得是对其药效作用研究的有益补充.