非人灵长类动物在病毒感染模型中的研究进展

黄涛张海涛李志雄曹华∗王心睿∗

(1. 福建省儿童医院,福州 350011; 2. 福建医科大学附属福建省妇幼保健院国家卫健委非人灵长类生育调节技术评价重点实验室,福州 350001; 3. 福建医科大学附属福建省妇幼保健院医学研究中心,福州 350001)

非人灵长类动物(non-human primates,NHP)在生理、认知能力、神经解剖学、社会复杂性、繁殖和发育等方面与人类具有高度相似性[1]。与人类的遗传物质有75% ～98.5%的同源性[2],这种同源性在基础和转化生物医学研究中发挥着重要的作用。啮齿类动物虽用途广泛,对回答许多基础研究问题非常有帮助,但由于缺乏灵巧的大脑结构,免疫系统和运动技能欠佳以及新陈代谢功能的差异等,限制了它们的用途。许多病原体(如流感、HIV 或登革热)对各自的宿主呈高度嗜性,用小鼠不能复制这种人类疾病,因此也限制了将小鼠用作某些传染病的模型[3-4]。由于NHP 与人类在生理和解剖学上的相似性,在某些方面的研究具有独特的优势和价值(表1),尤其对病原体的易感性,在病毒感染性疾病动物模型上更具有优势[5],是研究人类传染病最广泛使用的动物模型[6]。NHP 已经用于研究人类感染已有数十年的历史,在控制疾病参数和不受限制的组织获取能力的辅助下,在疫苗、药物疗法和其他免疫治疗方式的开发中发挥了重要作用。本文着重介绍NHP 在病毒感染性疾病动物模型中的研究进展。

表1 非人灵长类动物模型在生物医学研究领域的主要优势Table 1 Major advantages of non-human primate models for the areas of biomedical research

1 HIV 病毒感染模型

人类艾滋病(AIDS)是由HIV 病毒引起,该病毒被细分为 HIV-1 型(M、N、O 和 P 亚型)和 HIV-2 型(A 至I 亚型),其中HIV-1 型中M 亚型在世界上最普遍存在[7]。通过猿猴/人类免疫缺陷病毒(SHIV)感染NHP,能够模拟人类HIV 感染的大多数病毒学、免疫学和临床标志,现已用来研究HIV/AIDS 的传播、生理病理机制、免疫学和治疗干预措施的最合适模型[8],促进了有关cART(联合抗逆转录病毒疗法)治疗、免疫细胞耗竭效应、中和抗体的给药或产生、疫苗疗法和潜伏期逆转剂等的更深入研究[9]。

病毒感染诱导产生的抗体(Abs)可被直接用作预防或治疗,并且间接地用于帮助指导抗HIV 疫苗的设计[10]。HIV 病毒通过快速突变表面抗原蛋白位点从而避免被体内免疫系统反应产生的抗体而消灭,而广义中和抗体(bnAbs)能够靶向这些病毒带有高度保守的功能相关暴露位点而发挥作用[11]。通过SHIV 感染的恒河猴,刺激宿主免疫反应产生的中和HIV-1 特异性单克隆抗体具有强效的治疗效果[12]。在非人灵长类动物中感染猿猴/人类免疫缺陷病毒(SHIV)能够像人类一样产生bnAbs,这类SHIV/NHP 感染的恒河猴模型可作为研究bnAbs 的理想动物模型[13],为HIV-1 的单克隆抗体疗法提供研究思路。研究者从HIV 感染者体内分离出单独抗体,通过三元特异性中和抗体组合,从中找出了最佳的组合方式: VRC01 搭配 PGDM1400 和10E8v4,(三种抗体分别与病毒的CD4+结合位点,近膜外缘区域(MPER)和V1V2 多糖位点结合),在SHIV 非灵长类动物模型中具有完全的免疫力[14-15]。

HIV 病毒的感染有时会导致各种神经系统症状,统称为神经艾滋病(Neuro AIDS)。艾滋病感染早期,Neuro AIDS 最明显的表现形式为HIV 痴呆,在晚期表现为认知、运动和行为症状[16]。建立AIDS 和Neuro AIDS 的非人类灵长类动物模型对于研究HIV 感染中枢神经系统、神经病理学中发生的单核细胞和巨噬细胞蓄积至关重要。巨噬细胞的转移在神经系统发病中具有重要的作用[17],通过单克隆抗体实验性耗竭 CD8 淋巴细胞后感染的SIVmac251 恒河猴得到CD8 淋巴细胞耗竭模型,能够快速引起艾滋病感染和持续的高病毒血症[18],并加速巨噬细胞在中枢神经系统中的聚集[19]。同样使用重组抗CD4 抗体(CD4R1)在 SIVmac251 感染前消耗RM CD4+T 细胞建立的恒河猴模型,显示病毒复制大量增加并发展为艾滋病,巨噬细胞占淋巴结和粘膜组织中所有SIV vRNA+细胞的80%,促炎性单核细胞发生大量扩增,小胶质细胞也导致感染并异常激活[20]。通过分子克隆得到 SIVsm804ECL757(CL757)衍生病毒进一步开发了Neuro AIDS模型,诱导神经系统疾病过程中没有快速进展,因此更能反映出HIV 感染中Neuro AIDS 的进程,为研究中枢神经系统疾病进展和研究中枢神经系统病毒库提供有效模型[21]。

2 HBV 感染模型

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球慢性肝病的主要原因之一。病毒感染与细胞炎症、氧化应激和DNA 损伤相关,可能导致肝损伤,例如慢性肝炎、纤维化、肝硬化,最后引起肝细胞癌[22]。

黑猩猩是第一个被报道用于急性HBV 感染的动物模型,并在HBV 疫苗的研发上做出了巨大贡献[23],但是黑猩猩由于伦理的问题使用受到限制。一些大型猿猴如长臂猿猴和狒狒也被证明具有易感性,但是不及黑猩猩更接近于人类,在新的抗HBV 疗法研究中尤其是免疫治疗的发展受到了限制,而小型灵长类动物(新、旧世界猴)(图1)模型因此得到发展。由于种属特异性因素,导致其他灵长类动物难以感染,为了模拟HBV,通过离体杆状病毒介导HBV 基因组转移得到重组杆状病毒(Bac-HBV),在转导至原代恒河猴肝细胞第9 天后,检测到乙肝表面抗原分泌,以及病毒DNA、RNA 和共价闭合的环状DNA,因此显示了杆状病毒具有介导穿越物种屏障的作用[24],这种跨物种作用成功地建立了HBV 新世界猴模型。HBV 通过preS1 多肽与牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP,由SLC10A1 编码)结合侵入肝细胞[25-26],NTCP 是恒河猴肝细胞中乙型肝炎病毒感染的限制性宿主因子[27]。通过病毒载体介导NTCP 在恒河猴肝细胞中表达,能够使其易于感染HBV,并能够在血清中检测HBV 的DNA 以及肝细胞中检测HBV 的DNA、RNA 和HBV 核心抗原(HBcAg),成功建立了与HBV 感染相关的生理学模型[28]。基于人与松鼠猴之间NTCP 的高度同源性,用嵌入WMHBV(绒毛猴乙肝病毒)传染性基因组的相关腺病毒(AAV-WMHBV)感染松鼠猴,在肝中能够检测到共价闭合环状DNA,在新生和成年的松鼠猴感染模型中达到病毒血症持续时间比其他NHP 的长两倍多,持续维持6 ～8 个月的病毒血症,这可能作为测试HBV 治疗药物的合适模型,用于替代其他HBV-NHP 动物模型[29]。

图1 非人灵长类动物病毒感染模型Figure 1 Non-human Primate virus infection model

3 流感病毒感染模型

流感病毒分为甲型、乙型和丙型三类。乙型和丙型流感病毒能够分别导致季节性流感和小儿高热伴上呼吸道疾病[30]。甲型流感病毒能引起人类大流行和季节性流感,其表面包含血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种糖蛋白,并有多种亚型,HA在病毒结合和内化中执行关键功能,而NA 则促进病毒从细胞表面释放。人类甲型流感病毒亚型主要包括1918 年和2009 年的 H1N1 病毒,1957 年的H2N2 病毒和1968 年的H3N2 病毒,甲型流感病毒还包括新兴高致病流感病毒H5N1(1997 年香港爆发)和H7N9(2013 年在我国报道人类感染)等。由于大流行流感病毒人畜共患病死亡率较高,且比季节性流感病毒的感染性还要强,目前已成为重要的公共卫生问题。

3.1 H1N1 流感病毒模型

研究表明,用1918 年流感病毒感染食蟹猴能够引起高致病性呼吸道感染,最终导致急性呼吸窘迫和死亡[31]。此外,受感染的动物出现了以抗病毒应答失调为特征的免疫应答,但是不足以提供机体保护,这表明非典型的宿主固有免疫反应可能导致致死性。流感病毒调节宿主免疫反应的能力可能是高致病流感病毒的一个共同特征。Skinner 等[32]用2009 年大流行H1N1(pH1N1)流感病毒感染初生恒河猴,在感染的第1 天至第6 天未观察到临床症状,而是出现亚临床双相热。用带有血凝素(HA)或核蛋白(NP)的候选疫苗进行免疫,在亚临床恒河猴模型中,发现血液干扰素的活性是一个显著的标志物,并可作为评价流感病毒疫苗效力的指标。Safronetz 等[33]在建立食蟹猴模型的基础上,用大流行 初 期 ( A/Mexico/4108/2009 和 A/Mexico/InDRE4487/2009)两种遗传相似但临床上不同的SOIV(swine-origin influenza virus(SOIV)(H1N1))分离株感染食蟹猴,在临床疾病、病毒学、宿主反应以及组织病理学参数与季节性H1N1 病毒进行比较,显示出了更严重的感染,并观察到两种SOIV 分离株在病毒复制、宿主转录和细胞因子反应以及疾病进展方面的异质性。用猪源性大流行H1N1 菌株A/Mexico/InDRE4487/2009 对食蟹猴、恒河猴和普通绒猴进行比较研究发现,三种猴都容易受到感染,并发展为上下呼吸道感染[34]。食蟹猴和恒河猴疾病易感性进行比较,食蟹猴在上呼吸道和肺中的病毒复制水平显著更高,涉及病毒生产的峰值水平和持续时间,以及体温都较高,而在恒河猴中更容易观察到呼吸窘迫等临床症状。引起病毒的差异复制的原因可能是食蟹猴的气管和支气管中唾液酸-α-2,6-Gal 糖(人类甲型流感病毒的受体)的表达水平显著比恒河猴高(50 ～73 倍),结果显示出食蟹猴具有更均匀、更高水平的病毒复制以及体温的升高,这可作为大流行H1N1 流感病毒研究的模型[34-35]。在进行流行性病毒传播研究中,用2009年大流行性病毒A/California/07/2009(H1N1pdm)证明了人类流感病毒分离株可以有效地感染并在新世界猴种普通绒猴(Callithrix Jacchus)之间传播,被感染的动物经血清转化,表现出类似人的症状,这可能是研究流感病毒传播的可行模型[36],并且普通绒猴可作为季节性或高致病性禽流感病毒感染的动物模型[37]。

3.2 H5N1 流感病毒模型

1997 年高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1 在我国香港爆发,在禽类鸡中的感染死亡率高达75%,并在人类中引发严重疾病,死亡率高于50%[38]。较高的死亡率迫使需要NHP 感染模型来研究人类HPAIV 的发病机理以及开发针对HPAIV的新疫苗或药物。Kuiken 等[39]用甲型流感病毒A/Hong Kong/156/97(H5N1)感染四只食蟹猴,感染病变中坏死性支气管间质性肺炎在病理上与人类原发性流感病毒性肺炎相似,表明食蟹猴是用于研究人类H5N1 病毒感染的发病机制的合适动物模型。Muramoto 等[40]为了了解H5N1 病毒诱发人类严重疾病的机制,用6 种H5N1 病毒感染食蟹猴,比较了它们的致病性和对病毒感染的整体宿主反应,确定了由这些H5N1 病毒引起的病毒复制能力和疾病严重程度的差异,为哺乳动物中H5N1 病毒的发病机理提供了新的认识。Chen 等[41]用流感病毒 A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)感染恒河猴,产生了急性间质性肺炎和弥漫性肺泡损伤,表明肺是H5N1 病毒感染的主要目标器官,证实恒河猴适合作为H5N1 病毒研究的新灵长类动物模型尤其是H5N1 病毒传播的研究。

建立更接近自然传播途径的动物感染模型对研究病毒传播以及发病机制具有重要意义。在研究一种冷适应的减毒疫苗(AH/AAca)时,鼻内免疫两次的恒河猴能够诱导产生强大的中和抗体反应以及HA 特异性CD4+T 细胞免疫反应,引发针对高致病性H5N1 病毒感染的保护性免疫[42]。在前期NHP 感染模型中,是在气管内将含有流感病毒的悬浮液倒入肺中[43],而这在自然传播中并不会发生。Fujiyuki 等[44]使用日本分离株(A/whooper swan/Hokkaido/1/2008, H5N1 clade 2.3.2.1)对恒河猴和食蟹猴以小液滴接触方式在气管内进行接种,两种猴均观察到上下呼吸道感染及病毒脱落,较高剂量下接种恒河猴引起更严重的流感症状。通过气溶胶途径(吸入雾化)对高致病性H5N1 流感病毒进行了NHP 的实验性感染,食蟹猴吸入雾化的H5N1 流感病毒会导致暴发性肺炎,迅速发展为急性呼吸窘迫综合征,在整个肺叶引起更广泛的感染[45-46]。这种新方式感染的非人类灵长类动物模型将推进疫苗的研发和新的治疗方法,以预防和治疗由高致病性禽流感病毒引起的人类疾病。

3.3 N7N9 流感病毒模型

低致病性N7N9 流感病毒(LPAIV)于2013 年在中国报道,2017 年突变为高致病性菌株,导致人类严重感染并在中国八省家禽中爆发疫情[47]。用A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒株感染食蟹猴,可发展为短暂、轻度至重度疾病,肺的组织病理学变化与人类相似,虽然程度较轻,但有弥漫性肺泡损伤、多形核细胞浸润、透明膜形成、肺细胞增生和纤维增生变化,在呼吸组织上的附着模式与在人的附着模式更为相似[48-49]。与其他流感病毒相比,H7N9菌株 NA 中容易出现 R289 K、E119 V、A246T 或H274Y 突变,降低了神经氨酸酶抑制剂(NAI)的敏感性。食蟹猴模型可以预测体内出现抗NAI 钠抑制剂的H7N9 病毒的几率,这对新的NAI 的开发具有重要作用[50-51]。

4 登革热病毒(DENV)感染模型

登革热是伊蚊在人与人之间传播的全身性病毒感染性疾病,严重威胁着人的生命。目前已有128 个国家发现登革热病毒,影响全球一半以上人口,随着气候变化和城市化,登革热的传播范围也将进一步扩大[52]。由于可能缺乏反映登革热临床症状的动物模型,目前的预防和治疗策略还远远不足。有研究开发了小鼠登革热模型,用于研究DENV 发病机理和免疫应答[53]。但是小鼠模型在病理和病毒学分析方面具有一定局限性[54]。用新世界猴普通狨猴接种DENV,能够表现出高水平的病毒血症,并在淋巴结、脾和胸腺在内的淋巴器官及非淋巴器官检测到DENV 基因组,可作为研究继发性和原发性DENV 感染的动物模型,用于疫苗开发[55-56]。但是新世界猴在免疫反应方面与旧世界猴有所不同,主要包括在组织相容性复杂等位基因和抗体交叉反应性的差异[57]。用旧世界恒河猴接种DENV,出现较低水平的病毒滴度和较轻的症状[58],由于缺乏与DENV 相关的临床体征,登革热恒河猴模型可能不够完善,但通过改良的登革热恒河猴模型可能在早期评估登革热疫苗的效力和安全性可能存在作用[59]。通过接种DENV-409-48 株的旧世界猴冠毛猕猴(Macaca radiata),实验检测到DENV 非结构蛋白1 抗原,并观察到高病毒血症,表明用DV-409-48 感染的冠毛猕猴可以用作研究DENV 的可靠灵长类动物模型[60]。尽管非人类灵长类动物模型存在固有局限性,但通过一些模型改进,以及新的模型发现,这些模型结果仍然对研究致病机理,测试DENV 药物和评估登革热疫苗效力方面有重要价值。

5 SARS-CoV-2 感染模型

由新型β冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)[61]已扩散全球,病例数迅速增加,截止2020 年9 月6 日,累计感染人数达2676 万,死亡人数达87 万,全球疫情异常严峻。动物模型对于研究病毒感染发病机制以及特异的治疗药物或疫苗不可或缺,因此开发针对SARS-CoV-2的动物模型用于研究病毒发病机制,评估和筛选针对于新冠肺炎的候选药物或疫苗迫在眉睫。秦川团队利用ACE2 转基因小鼠率先制备了新冠病毒模型,研究病毒在小鼠模型中的组织病理学,阐明了hACE2 小鼠中 SARS-CoV-2 的致病性[62]。并建立了年轻和老年恒河猴感染模型,揭示了SARS-CoV-2引起的老年猴间质性肺炎比幼猴严重[63],提供了深入了解其致病机制的信息,并促进了针对预防SARS-CoV-2 的疫苗和COVID-19 治疗药物的开发。通过对恒河猴气管接种,组织病理学观察表明,SARS-CoV-2 感染可引起间质性肺炎,其特征在于充血和水肿,以及肺泡中单核细胞和淋巴细胞的浸润。在呼吸道组织(包括气管、支气管和肺)中鉴定出SARS-CoV-2 RNA。并且还分别从口咽拭子、支气管和肺中分离出病毒[64-66]。并有研究小组建立了年轻和老年食蟹猴 SARS-CoV-2 感染模型,与MERS-CoV 和SARS-CoV 发病机制进行了比较,显示出不同的临床特征,为疾病的预防和治疗提供了依据[67]。研究显示原发性SARS-CoV-2 感染可以激发免疫保护机制,并能够避免再次感染[68-69]。非人灵长类动物在此次SARS-CoV-2 的研究中提供了一个有价值的动物模型平台,为疾病的预防提供了重要依据,并为该疾病机制的研究,药物的研发疫苗的评价提供有用模型,大大加快了人们攻克新冠肺炎的速度。

6 其他病毒感染模型

除以上NHP 病毒感染模型外,NHP 还用于寨卡病毒(ZIKV)[70]和巨细胞病毒(CMV)[71]等病毒感染模型(图1)。NHP 在阐明ZIKV 发病机理和评价候选疫苗方面已经发挥了巨大作用[72],并在新旧世界猴中恒河猴[73]、食蟹猴[74]、普通狨猴[75]、松鼠猴和枭猴[76]等中制造出早期怀孕期间感染模型,证实了胎儿神经病理学,以及小儿畸形和其他先天性寨卡综合征[77]。CMV 非人灵长类动物模型已被用于研究CMV 发病机制、原发感染的免疫应答以及后遗症,这种非人类灵长类动物模型为研发HCMV 疫苗带来进一步的可能[78-80]。NHP 还用于 EBOV、GBV-B 等病毒感染研究,并必将为今后可能出现的新型病毒继续做出重要贡献。

7 小结与展望

NHP 对人类致病性病毒具有极度易感性,能够有效模拟人类病毒感染性疾病,并随着NHP 实验动物模型制备的不断完善,对疾病的发病机制研究,以及药物的开发和疫苗评价具有不可估量的作用。但是非人灵长类动物作为国家保护动物,资源比较稀缺,所以进一步发展并扩大NHP 种质资源具有重要意义,尤其是SPF 级(无特定病原体)非人灵长类实验动物。NHP 不仅在病毒感染性疾病中的具有重要应用,还在脑科学、生殖生育、器官移植、干细胞研究等领域也具有重要应用,相信在未来的医学发展与进步上,NHP 将会发挥出更加不可估量的价值。