阿里红多糖体内抗肿瘤作用及其机制研究

沙依拜沙比提丛媛媛古丽尼歌尔阿布都米吉提帕丽达阿不力孜

(新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830011)

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病,寻找有效的抗癌药物和方法是世界医学面临的重要课题。研究发现中药治疗恶性肿瘤,无论是在减轻临床症状,提高生存质量,防止复发转移,延长生存期,还是在与放化疗配合,增效减毒等方面都有很好的效果。

阿里红(Fomes Officinals(Vill.ex.Fr.) Ames)是一种药用菌,隶属多孔菌科、层孔菌属[1]。研究发现,阿里红中所含多糖(FOPS)为阿里红药材的活性成分之一,具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[2-4]。课题组前期研究表明阿里红多糖在体外具有抗肿瘤活性[5],但鲜有阿里红多糖体内抗肿瘤作用的报道。因此,本研究使用S180 荷瘤小鼠,研究阿里红多糖体内抗肿瘤作用效果和机制,旨在为后续阿里红药效学研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60 只6 周龄SPF 级雄性昆明小鼠,体重18 ～20 g,购买于新疆医科大学动物实验中心【SCXK(新)2018-0002】。饲养于新疆医科大学动物实验中心【SYXK(新)2018-0003】。饲养期间各组小鼠自由饮水,饲喂普通维持饲料由新疆医科大学动物实验中心提供。饲养环境:昼夜各半循环照明,恒温 22 ～ 25℃、恒湿 40% ～ 70%。鼠源 S180 腹水瘤细胞,购自上海中乔新舟公司,由新疆医科大学动物实验中心传代保种。所有操作均符合新疆医科大学伦理委员会要求( 批准文号: IACUC-20170222046)。

1.1.2 试药

阿里红药材购于新疆维吾尔医院,由新疆医科大学天药/生药教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为阿里红Fomes OfficinalsAmes。按文献[6]制备FOPS,得率为3.06%,通过苯酚硫酸法测得含量为57.4%,用生理盐水制备5、10、20 mg/mL 药液待用。注射用环磷酰胺(CTX, 盛迪医药有限公司,18102525),生理盐水制备成5 mg/mL 药液待用。

1.1.3 主要试剂与仪器

TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒(安徽巧伊生物公司);引物β-actin、p38MAPK、p-cjun(上海生工生物有限公司);抗体β-actin(CST 公司);p38MAPK、p-NF-κB(Abcam 公司);p-c-jun、NF-κB(Bioswamp 公司);BCA 蛋白定量试剂盒、蛋白分子量标准Marker、特超敏ECL 化学发光试剂盒(索莱宝公司);实时荧光定量PCR 试剂盒(TaKaRa 公司)。

Multiskan Go 全波长酶标仪(美国 Thermo 公司);AB304-S 电子分析天平(德国梅特勒公司);UV2700 紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);3-30 K 台式低温离心机(德国 Sartorius 公司);BC-5000VET 血细胞分析仪(中国Mindray 公司)。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤模型制备

常规方法复苏S180 小鼠腹水瘤细胞,取0.2 mL 细胞悬液注射于健康小鼠腹腔,连续传代两次得到S180 腹水瘤小鼠。无菌条件下抽取腹水,调整浓度至每毫升1 × 107个,注射细胞悬液于适应饲养7 d 后的小鼠腋部皮下制备S180 荷瘤模型。

1.2.2 动物分组及给药

将50 只建模成功小鼠随机分为模型组、阳性对照组、FOPS 低、中、高剂量组,健康小鼠作为空白组,每组10 只。空白组与模型组给予生理盐水灌胃,阳性对照组腹腔注射50 mg/kg 环磷酰胺,低、中、高剂量组给予不同浓度(50、100、200 mg/kg)FOPS 灌胃,连续给药15 d。每日记录小鼠体重,观察小鼠饮食饮水、活动状态等一般表现。

1.2.3 抑瘤率及脏器指数检测

末次给药24 h 后,颈椎脱臼处死小鼠,剥离瘤块、脏器称重,计算抑瘤率、脏器指数。抑制率(%)=(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%,脏器指数=脏器质量/体重。

1.2.4 外周血血常规检测

小鼠取血,BC-5000Vet 血细胞分析仪检测白细胞、淋巴细胞数目。

1.2.5 血清细胞因子含量检测

小鼠取血,静置2 h,4℃条件下3000 r/min 离心10 min 分离血清。按照ELISA 试剂盒说明书检测血清 TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-1β、IL-6 含量。

1.2.6 小鼠脏器病理学观察

剥离心、肝、脾、肺、肾等组织用4%甲醛固定,经石蜡包埋、切片、HE 染色观察病理学变化。

1.2.7 肿瘤组织 p38MAPK 和p-c-junmRNA 表达量检测

液氮研磨适量肿瘤组织,使用TRIzol 试剂提取总RNA,测定RNA 总浓度,使用PCR 循环仪进行逆转录。用 qRT-PCR 定量检测 p38MAPK 和p-c-junmRNA 表达量,用 2-△△Ct分析法计算结果,引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.8 肿瘤组织 p38MAPK、p-c-jun、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表达量检测

液氮研磨适量肿瘤组织,加入RIPA 裂解液提取蛋白。在4℃条件下,12 000 r/min 离心10 min,取上清液,使用BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。适宜条件下,进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育,二抗孵育等步骤。ECL 化学发光试剂曝光显影,Image J 图像分析法进行灰度值分析。

1.3 统计学分析

通过SPSS 21.0 软件进行统计学分析,采用单因素方差分析,数据结果以平均值± 标准差(±s)表示,P< 0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FOPS 对荷瘤小鼠体重的影响

第1 ～3 天各组小鼠一般表现正常。第4 ～7天小鼠腋部皮下出现明显瘤组织;模型组与阳性对照组小鼠皮毛粗糙、精神萎靡,与模型组比较,FOPS低、中、高剂量组小鼠精神状态、饮食状态良好。第8 ～15 天模型组小鼠瘤组织较大、右肢失去功能、皮毛稀松,阳性对照组食欲差、呼吸急促,由图1 可见,体重下降,差异有显著性(P< 0.01)。与模型组比较,FOPS 低、中、高剂量组皮毛光滑、体重变化小,差异无显著性。

注:与模型组比较,*P< 0.05,∗∗P< 0.01。(下图/表同)图1 FOPS 对荷瘤小鼠体重的影响(n=10)Note. Compared with model group,*P< 0.05,∗∗P< 0.01. (The same in the following figures and tables)Figure 1 Effect of FOPS on body weight of tumor-bearing mice(n=10)

2.2 FOPS 对荷瘤小鼠瘤重、抑瘤率的影响

由表2 可见,与模型组比较,阳性对照组、FOPS低、中、高剂量组小鼠平均瘤重均明显减小,差异有显著性(P< 0.05),FOPS 低剂量组小鼠平均瘤重小于FOPS 中、高剂量组。阳性对照组、FOPS 低、中、高剂量组抑瘤率分别为84.87%、54.29%、40.57%、30.84%。结果提示,FOPS 对S180 荷瘤小鼠肿瘤生长有抑制作用。

表2 FOPS 对荷瘤小鼠瘤重、抑瘤率的影响(n=10)Table 2 Effect of FOPS on tumor weight and tumor inhibition rate of tumor-bearing mice(n=10)

2.3 FOPS 对荷瘤小鼠脏器指数、白细胞、淋巴细胞数目的影响

由表3 可见,与模型组比较,FOPS 低、中剂量组小鼠脾指数、胸腺指数、白细胞数目均显著升高(P< 0. 05),FOPS 低剂量组淋巴细胞数目显著升高(P< 0. 05)。结果提示,FOPS 可提高荷瘤小鼠脾指数、胸腺指数,升高白细胞、淋巴细胞数目。

2.4 FOPS 对荷瘤小鼠血清细胞因子的影响

由表4 可见,与模型组比较,FOPS 低、中剂量组TNF-α 含量均显著升高(P< 0.05),FOPS 低剂量组IFN-γ 含量显著升高(P< 0.05),FOPS 低、中、高剂量组IL-2 含量显著升高(P< 0.05),FOPS 低、中、高剂量组 IL-1β、IL-6 含量显著降低(P< 0.01)。该结果提示 FOPS 可升高荷瘤小鼠血清 TNF-α、IFN-γ、IL-2 含量,降低 IL-1β、IL-6 含量。

2.5 FOPS 对荷瘤小鼠脏器病理学的影响

由图2 知,各组小鼠心脏组织切片心肌纤维排列整齐,形态正常。空白组肝细胞结构完整,排列整齐,胞质丰富,核仁清晰;模型组与阳性对照组肝细胞排列分散无序,与模型组比,FOPS 低、中、高剂量组小鼠肝细胞排列规则,形态基本正常。空白组小鼠脾组织细胞排列整齐紧密,红髓与白髓分界清晰;模型组与阳性对照组小鼠脾组织红髓与白髓分界不清,不易观察;与模型组比,FOPS低、中、高剂量组小鼠脾组织细胞排列相对整齐,红髓和白髓分界可见。各组小鼠肺组织切片组织结构疏松呈蜂窝状,未见炎细胞浸润现象。空白组肾组织细胞形态正常,结构完整;模型组肾组织细胞排列紊乱,肾小球体积减小;与模型组比较,FOPS 低、中、高剂量组肾小球结构相对完整,细胞排列相对整齐。

2.6 FOPS 对荷瘤小鼠肿瘤组织p38MAPK 和pc-jun mRNA 表达的影响

由表5 可见,与模型组比较,FOPS 低、中剂量组小鼠p38MAPK mRNA 表达量升高,差异具有显著性(P< 0.05),FOPS 低剂量组小鼠p-c-junmRNA 表达量升高,差异具有显著性(P< 0.01)。

表3 FOPS 对荷瘤小鼠脏器指数、白细胞、淋巴细胞数目的影响(n=10)Table 3 Effect of FOPS on organ index, WBC and LYM of tumor-bearing mice(n=10)

表4 FOPS 对荷瘤小鼠血清细胞因子的影响(n=10)Table 4 Effect of FOPS on serum cytokines of tumor-bearing mice(n=10)

2.7 FOPS 对荷瘤小鼠肿瘤组织 p38MAPK、p-cjun、NF-κB 和 p-NF-κB 蛋白表达的影响

由表6、图3 可见,与模型组比较,FOPS 低剂量组p38MAPK 表达量升高,差异具有显著性(P<0.05),FOPS 低、中剂量组p-c-jun表达量均升高,差异具有显著性(P< 0.05),FOPS 低、中、高剂量组p-NF-κB 表达量均升高,差异具有显著性(P<0.01)。

表5 FOPS 对荷瘤小鼠肿瘤组织p38MAPK 和p-c-jun mRNA 表达的影响(n=6)Table 5 Effect of FOPS on p38MAPK and p-c-jun mRNA expression in tumor tissues of tumor-bearing mice(n=6)

图2 FOPS 对荷瘤小鼠脏器病理学变化的影响Figure 2 Effect of FOPS on histopathological changes in tissues of tumor-bearing mice

表6 FOPS 对荷瘤小鼠肿瘤组织 p38MAPK、p-c-jun、NF-κB 和 p-NF-κB 蛋白表达的影响(n=6)Table 6 Effect of FOPS on p38MAPK, p-c-jun, NF-κB and p-NF-κB protein expression in tumor tissues of tumor-bearing mice(n=6)

图3 FOPS 对荷瘤小鼠肿瘤组织p38MAPK、p-c-jun、NF-κB 和 p-NF-κB 蛋白表达的影响Figure 3 Effect of FOPS on p38MAPK, p-c-jun, NF-κB and p-NF-κB protein expression in tumor tissues of tumor-bearing mice

3 讨论

3.1 FOPS 对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

恶性肿瘤治愈率低、致死率高,是严重危害人类健康的疾病之一[7]。环磷酰胺等抗肿瘤药物对多种实体瘤有良好的抑制作用,在小鼠S180 移植瘤模型中常被用作阳性对照药。但其消化道反应、生殖毒性、骨髓抑制及免疫抑制等严重毒副作用及不良反应[8],对人体产生较大损害。天然来源的植物多糖具有调节机体免疫、增强抗肿瘤活性、抗病毒、抗氧化等众多功效,且毒性反应及副作用小[9-11]。本研究结果显示,与模型组比较,FOPS 低、中、高剂量组小鼠瘤重均减小,差异具有显著性(P< 0.05),FOPS 低剂量组抑瘤效果优于FOPS 中、高剂量组。通常,药物在一定范围内具有优良效果,超过范围药效降低、消失甚至产生毒副作用。该结果表明,FOPS 对荷瘤小鼠肿瘤生长具有抑制作用,从量效关系来看不同浓度的FOPS 对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用不同,并不是剂量越大药效越好。造成这种剂量与药效关系不成正比的原因可能是,FOPS是粗多糖,其中不同的多糖组分可能具有各自的作用途径或有效浓度范围,对不同的组织、细胞和细胞因子表达产生的影响可能不同。并且,中药存在多成分、多靶点的特性,FOPS 剂量升高可能抑制或激活了其他作用靶点或受体,使其抗肿瘤活性降低。

3.2 FOPS 对荷瘤小鼠免疫功能的影响

脾和胸腺是哺乳动物最主要的免疫器官。脾和胸腺发生功能或器质性改变,表现为淋巴细胞、白细胞减少和细胞因子的改变,极大增加细菌和病毒感染的机会[12-14]。本研究结果显示,FOPS 可提高荷瘤小鼠脾指数、胸腺指数,升高小鼠外周血白细胞、淋巴细胞数目,差异具有显著性(P< 0.05),该结果提示FOPS 改善机体免疫功能。

3.3 FOPS 对荷瘤小鼠细胞因子的影响

TNF-α 是由单核细胞与巨噬细胞产生的多肽类细胞因子,对肿瘤具有直接溶解和抑制增殖的作用。IFN-γ 由淋巴细胞与NK 细胞产生,可通过增加TNF-α 的释放来达到杀伤肿瘤细胞的作用。IL-2 可促进IFN-γ 分泌,也可促进 T、B 细胞活化和增殖,并最终提高细胞和体液反应[15-16]。IL-6、IL-1β 的大量产生则会引起广泛的炎症反应,促进肿瘤侵袭转移[17-18]。研究表明,FOPS 升高 TNF-α、IL-2、IFN-γ等细胞因子含量(P< 0.05),降低IL-6、IL-1β含量(P< 0.01),从而发挥抗肿瘤作用。

3.4 FOPS 对荷瘤小鼠脏器病理学的影响

本研究通过对心、肝、脾、肺、肾等脏器进行病理学观察考察FOPS 的安全性,结果显示FOPS 能减轻荷瘤小鼠脏器损伤,并且安全性较高。

3.5 FOPS 对 MAPK/NF-κB 信号通路的影响

MAPK/NF-κB 信号通路在多种肿瘤组织及细胞内活化表达,已成为研究抗肿瘤药物的热门靶点之一。MAPK 是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶,与细胞周期调节、细胞存活、细胞因子分泌等过程有关[19-20]。NF-κB 在细胞受到刺激时发生磷酸化,从细胞质进入细胞核内,与核内DNA 特异序列结合,启动或增强相关基因转录。在癌症早期,NF-kB 可以抑制肿瘤生长,但突变的积累可能导致肿瘤抑制功能丧失。NF-κB 被视为应激反应因素,在炎症过程中同时产生促炎和抗炎介质,发挥何种作用抑制肿瘤取决于时间和组织[21]。本研究结果表明,FOPS 能够上调肿瘤组织 p38MAPK 和p-cjunmRNA表达及 p38MAPK、p-c-jun和p-NF-κB 蛋白表达,差异具有显著性(P< 0.05),激活MAPK/NF-κB 信号通路发挥抗肿瘤作用。

综上所述,体内给予FOPS 可抑制S180 荷瘤小鼠肿瘤生长,调节荷瘤小鼠血清细胞因子含量,其机制与激活MAPK/NF-κB 信号通路有关。