注射突变p53 基因CRISPR/Cas9 质粒和肝癌细胞建立肝癌小鼠模型

王燕鸽高子涵李宗霖王康龙白雪李瑞芳有曼王红伟

(河南科技大学基础医学院药学系,河南省肝病防治工程技术中心,河南洛阳 471023)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐渐升高[1]。建立一种良好的循环肝癌细胞肝转移动物模型是研究和治疗肝癌的前提[2]。目前常见的肝癌建模方法有:化学诱导法、原位移植法、基因修饰法,化学诱导法会消耗大量的人力物力和时间;移植性肝癌模型不适用于所要研究的方向;所以,目前缺乏模拟人类循环肝癌细胞导致的肝内复发转移的动物模型[3]。研究发现,采用尾静脉注射的方法形成肝转移,从而成功构建出循环肝癌细胞肝转移动物模型[4]。肿瘤抑制基因p53 作为基因组的守卫者,在细胞应激反应中对细胞发挥多种作用,目前研究p53 基因治疗肝癌是一个突破点[5]。另有研究证明,p53 基因的突变与肝癌的病理密切相关,突变率与肝癌分化呈负相关。所以人工注射靶向突变人p53 基因,借此来调节小鼠的正常p53 基因的表达[6]。CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以进行基因敲除,可编程性以及可同时编辑多个基因[7]。通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术,敲除正常的p53 基因下调小鼠p53 基因的表达,构建出符合人类肝癌患病机制的动物模型[8]。本研究拟采用尾静脉注射突变p53 基因CRISPR/Cas9 质粒和H22 细胞的方法建立一种转移性肝癌小鼠模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

100 只 8 周龄 SPF 级雄性 BALB/c 小鼠,体重(20 ± 2)g,购自于华中科技大学同济医院实验动物中心【SCXK(苏)2017-0001】。饲养期间各组小鼠自由饮水,饲喂普通维持饲料由河南省正骨研究院动物实验室【SYXK(豫)2015-0001】提供。饲养环境:维持12 h:12 h 昼夜循环(7:00 ～ 19:00),湿度恒定50%,温度控制在22 ～25℃。按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。H22 肝细胞株,购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,由本研究室保存传代。

1.1.2 主要试剂与仪器

质粒DNA 大量抽提试剂盒、免疫组化试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒均购自于北京索莱宝;AST、ALT 检测试剂盒(南京建成);Western Blot 实验系统(北京六一),抗体(武汉三鹰);荧光及化学发光成像系统(美国Bio-Rad 公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备

100 只BALB/c 小鼠,随机分为四组,空白组和质粒组,实验组和对照组。每组25 只,实验组注射每毫升 1 × 106个的 H22 肝癌细胞+ 60 μg 的质粒,对照组小鼠只进行注射每毫升1 × 106个的H22 肝癌细胞,空白组尾静脉注射同等体积的生理盐水,质粒组注射质粒。注射后的小鼠,正常进行喂食喂水,记录第1 ～5 周生活状态、生理情况及体重。观察是否形成腹水。

1.2.2 血清学检测

注射2、3、4、5 周随机抽取小鼠数只,眼眶取血,3000 rpm 4℃离心,取上清液,按照试剂盒说明书检测血清转氨酶(ALT、AST)水平,评估各组小鼠的肝损伤程度,进行比较。

1.2.3 脏器大体观察

解剖处死的小鼠,取其肝,进行称重。观察脏器颜色、外观,记录脏器是否有转移结节或病变。计算各组小鼠的脏器指数、成模率、死亡率。

1.2.4 组织学检测

(1)HE 染色:取肝组织在4%甲醛中固定12 h,流水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋切片,进行HE 常规染色,在显微镜下观察、拍照记录。

(2)免疫组织化学:切片进行常规脱蜡水化,抗原修复,3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,血清封闭。用p53、PCNA 抗体将切片在4℃条件下孵育过夜。按照说明书Masson 染色,进行中性树胶封片,显微镜下观察,拍照记录。

1.2.5 Western Blot 检测肝组织中p53 和PCNA 蛋白的表达情况

提取肝组织总蛋白,定量,取蛋白样品100 μg,经SDS-PAGE 电泳后,转膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,PBST 洗 2 次,一抗p53 (1 ∶2000) 和 PCNA(1 ∶2000)于杂交膜内,37℃孵育 1 h。PBST 洗 3 次,加入二抗(1 ∶6000)37℃孵育1 h,ECL 发光法显色,得出结果。

1.3 统计学分析

本次实验的数据采用SPSS 17. 0 软件进行数据的统计学分析,实验所用数据均以平均值 ± 标准差(±s)表示,多组间的数据比较将采用单因素方差分析法进行。组间的两两比较将采用Tukey’s test 方法进行。P< 0. 05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠成模率及死亡率

在建模过程中,由于注射原因导致3 只小鼠死亡。实验组仅在第2 周有1 只小鼠死亡,经计算成模率为60.87%,死亡率为4.35%。而对照组小鼠则在第2 周时有5 只死亡,第3 周时有2 只死亡,通过计算成模率为45.83%,死亡率为29.17%。

2.2 小鼠血清转氨酶水平变化

经检测,实验组小鼠血清ALT、AST 水平分别增加至(28.2 ± 2.4)和(47.1 ± 4.7);对照组小鼠血清 ALT、AST 水平分别增加至(19.6 ± 1.6)和(38.6± 2.3)(P< 0.01)(见图1)。

注:与空白组比较,∗∗P < 0.01;与对照组比较,##P < 0.01。(下图同)图1 血清检测各组小鼠ALT、AST 水平Note. Compared with the blank group, ∗∗P < 0.01. Compared with the control group, ##P < 0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Serum levels of ALT and AST in mice of each group

2.3 脏器大体观察

实验组与对照组小鼠的肝部发生不同程度的病变,在肝部表面均出现明显的灰白色结节,质地较硬,并随着周数的增加肝部结节数明显增多,体积增大(P< 0.05)(见图2,3)。

注:与空白组对比,*P < 0.05,∗∗P < 0.01。图2 肝移植模型对小鼠肝指数的影响Note. Compared with blank group, *P < 0.05, ∗∗P < 0.01.Figure 2 Effect of liver transplantation model on liver indexes of mice

2.4 HE 染色观察组织病理学变化

空白组与质粒组小鼠的肝组织结构较为正常,无病灶和癌巢结构。第2 周实验组小鼠的肝小叶结构遭到破坏,肝索较为紊乱。第3 周时,实验组与对照组肝小叶结构均有不同程度的破坏,实验组的肝组织中出现点灶样坏死和癌巢结构。第4 周时,对照组与实验组中病灶部位与正常结构有着明显的分界线,实验组的病灶部位相对较大且数目较多。在第5 周时,实验组与对照组小鼠肝的肝小叶可见大面积癌变部位。病灶部位胞核密集且深染,胞质较少且色浅,可见分裂相细胞核,部分病变细胞排列成条索状,呈明显肿瘤病理学改变(见图4,5)。

2.5 免疫组织化学法检测小鼠肝内p53 和PCNA的表达

免疫组化结果表明,空白组小鼠的肝组织内有p53 阳性表达较高,对照组的癌巢内p53 表达下降,质粒组与实验组p53 阳性表达率明显降低,低于对照组。(P< 0.05)。实验组与对照组的小鼠肝组织癌巢中,均出现了不同程度的PCNA 阳性表达,并且实验组表达明显高于对照组(P<0.05)(见图6,7)。

图3 实验组与对照组1 ～5 周肝比较Figure 3 Comparison of liver in test group and control group at 1 ～5 weeks

图4 第5 周时各小组肝组织病理学比较Figure 4 Histopathological comparison of liver in each group at the 5 week

图5 实验组与对照组1 ～5 周肝组织病理学比较Figure 5 Histopathological comparison of liver between test group and control group at 1 ～5 weeks

2.6 Western Blot 检测小鼠肝组织内 p53 和PCNA 蛋白表达

质粒组与实验组小鼠肝组织中的p53 蛋白的表达量明显的低于空白组,而对照组小鼠肝组织中p53 蛋白表达与正常组相比稍降,差异无统计学意义(P< 0.01)。对于小鼠肝组织中PCNA 蛋白表达与空白组或质粒组相比,对照组和实验组小鼠肝组织内PCNA 的表达量有着明显的增高;并且实验组PCNA 的表达量要显著高于对照组(P< 0.05)(见图8)。

图6 免疫组织化学法检测小鼠肝组织内p53 和PCNA 表达Figure 6 Detection of p53 and PCNA expression in mouse liver tissue by immunohistochemistry

图7 免疫组织化学法检测小鼠肝组织内p53 和PCNA 表达Figure 7 Detection of p53 and PCNA expression in mouse liver tissue by immunohistochemistry

图8 Western Blot 检测小鼠肝组织内p53 和PCNA 蛋白表达Figure 8 Western Blot detection of p53 and PCNA protein expression in mouse liver tissue

3 讨论

在2 周后,发现空白组质粒组小鼠精神状态较好,无明显病态,对照组和实验组的小鼠精神状态较差,进食量减少。对照组与实验组小鼠可能因体内肺或肝出现病变,导致精神状态的下降。

根据结果得出, 实验组小鼠的成模率为60.87%,死亡率为4.35%;对照组小鼠的成模率为45.83%,死亡率为29.17%。与仅注射H22 细胞的小鼠的对照组比较,实验组小鼠的建模成功的概率更高,存活率有了一定的提高。本研究在5 周较短的时间成功构建出肝癌肿瘤的转移模型。与对照组比较,实验组结节与囊肿出现的时间早,病变程度高,肝癌形成更加快速和严重。

HE 染色结果显示,实验组与对照组肝能够观察到细胞肿瘤样改变和癌巢存在,这表明构建的模型产生癌变,建模成功。与空白和质粒组相比,实验组小鼠血清转氨酶ALT、AST 水平显著增加,表明实验组与对照组的肝功能明显受损。与对照组比较,实验组的转氨酶ALT、AST 水平要明显高于对照组。结合成模率和死亡率、肝大体和病理形态学结果,可以得出以下结论:本文利用基因编辑技术构建肝癌模型的方法要显著高于常规尾静脉注射H22细胞的建模方法。

第5 周质粒组与实验组的p53 蛋白低于正常值是因为,通过尾静脉将突变人p53 基因之CRISPR/Cas9 三合一工具质粒注射入小鼠体内,此质粒可定点突变p53 抑癌基因,导致小鼠肝组织正常p53 基因的表达下调[9]。PCNA 是评价细胞增殖状态的指标之一[10]。第5 周时实验组和对照组小鼠肝组织内PCNA 的表达高于空白组和质粒组,大多位于癌巢及与正常肝组织交界处,说明肝癌细胞处于高增殖状态并将进一步恶化。并且实验组的PCNA 表达程度明显高于对照组。说明实验组细胞增殖程度要高于对照组。对于PCNA 来说,因为对照组与实验组发生了肝转移,所以这两组的PCNA 表达量要高于空白组与质粒组。

通过尾静脉注射靶向突变人p53 基因之CRISPR/Cas9 三合一工具质粒和肝癌细胞的方法快速建立肝癌小鼠模型的增加两个关键点,突变人p53 基因和CRISPR/Cas9 基因编辑技术。该方法模型构建周期短,成功率高,节约成本,可用于肝癌转移和复发的防治研究。