沙门菌中GcvB sRNA可调控aphA mRNA

杨 阳 ，曹 伟 ，潘 永 ，段世宇 ，杨 琦 ,4

（1.贵州大学动物科学学院，贵阳550025；2.贵州大学动物疫病研究所，贵阳550025；3.巴彦淖尔市兽医事业管理局，巴彦淖尔015000；4.贵州省动物疫病研究室，贵阳550025）

沙门菌（Salmonella）是一种严重危害人类与动物健康的革兰氏阴性菌，能够导致人与动物发生肠炎、食物中毒、败血症等一系列粘膜免疫反应疾病，还可造成母畜流产、死亡，在中国所发生的食物中毒原因中有70%～80%由沙门菌引起。沙门菌对我国动物福利和公共卫生问题有着巨大的影响[1-4]。在沙门菌中，aphA基因可编码蛋白B类酸性磷酸酶（class B acid phosphatase/phosphotransferase），这类酶的主要生理功能包括：催化和水解多种磷酸底物，催化低能量的磷酸集团从磷酸单酯向羟基集团的转移[5]。在细菌中，磷酸集团的转移是细菌能量代谢的主要途径之一，若破坏磷酸集团的催化，细菌的生理活动将受到重要影响，细菌的生存和定植能力均会降低。

非编码的小RNA（noncoding small RNA，sRNA）是细菌中基因表达的主要转录后调节因子，大小为30～500 nt，是一类可进行转录而不翻译为蛋白质的RNA分子，sRNA可通过与特定的mRNA靶标结合而对细菌功能作出调节。沙门菌中所存在的sRNA是革兰氏阴性细菌中与伴侣蛋白Hfq（保守的RNA分子伴侣蛋白RNA-binding protein Hfq）相关性最高的小RNA之一，能与伴侣蛋白Hfq共同作用于细菌各种细胞功能如：生长增殖、糖转运、压力应答、营养物质吸收、毒性毒力和环境应激等生命活动并产生一定的影响[6-9]。GcvB sRNA是沙门菌中1个极保守、长度为200个核苷酸的小RNA，具有广泛且重要的调节能力，可调控沙门菌中约1%～2%的mRNA，多为氨基酸与短多肽的转移蛋白，包括了ABC转移蛋白家族中的Dpp蛋白和Opp蛋白[10]。目前研究可知，GcvB有3个调控区域，分别为：位于茎环SL1和SL2之间一个29 nt长的G/U丰富的单链序列的R1区域、位于茎环SL3和SL4之间序列为ACUUCCUGUA的R2区域及位于茎环SL4上的R3区域[11-12]。

lacZ能够通过aphA的起始密码子ATG进行翻译，表达β-半乳糖苷酶[13]，本研究通过构建aphA与lacZ的融合基因ΔaphA::lacZ，并以其为对照检测缺失GcvB后，aphA相对转录量与β-半乳糖苷酶活性差异变化，研究GcvB对aphAmRNA水平与蛋白水平的调控作用，以期为sRNA的后续研究与沙门菌防治提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌株及试剂 鼠伤寒沙门菌标准株LT2（wild type，wt）和鼠伤寒沙门菌gcvB基因缺失株（基因型ΔgcvB::cat）（人为构建所得[14]）均由法国国家科学研究中心（Centre national de la recherche scientique，CNRS）分子遗传学Bossi实验室馈赠；鼠伤寒沙门菌GcvB R1基因缺失株（基因型ΔgcvBR1::cat）、鼠伤寒沙门菌GcvB R2基因缺失株（基因型ΔgcvBR2::cat）和鼠伤寒沙门菌GcvB R3基因缺失株（基因型ΔgcvBR3::cat）均由本实验室构建所得。

质粒pKD46（λ red同源重组质粒，携带氨苄抗性基因）、质粒pCP21（flp重组酶，可识别frt位点）、质粒pCE40（携带frt位点与lacZ基因，但lacZ无启动子）、质粒pKD13（携带frt位点，携带有卡那霉素抗性基因）和P22噬菌体均由CNRS分子遗传学Bossi实验室馈赠。

细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix ExTaqⅡ购自TaKaRa公司；pfu和TaqDNA聚合酶、ONPG购自北京索莱宝科技有限公司；QIAquick PCR Purification Kit（50）购自生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均为分析纯。抗生素浓度：氨苄西林100 mg/mL、氯霉素 20 mg/mL、卡那霉素 50 mg/mL。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 电转化 以质粒pKD13作为模板，使用引物P1/P2进行PCR，扩增体系为：pKD13（1∶20）10 μL，缓冲液8 μL、ddH2O 57 μL，上、下游引物各1 μL，dNTPS Mix（2.5 mmol/L each）2 μL，Taq酶和pfu酶混合物（3∶1）1 μL；反应程序为：95℃变性10 s，53～60℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30个循环。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收并纯化扩增产物。

感受态细菌的构建：将700 μL过夜菌株置于70 mL LBA中，加入L-阿拉伯糖培养菌株7455 OD600值为0.4～0.6。取菌液35 mL置于离心管中，离心后弃上清液。沉淀中加入35 mL的10%甘油，混匀后离心并弃上清液，沉淀中加入17.5 mL的10%甘油进行悬浮，再次离心后弃上清液。沉淀中加入9 mL的10%甘油，混匀后离心并弃上清液，沉淀中加入200 μL的10%甘油进行悬浮。

电转化：取50 μL感受态细菌与5 μL纯胶回收产物（或质粒）在冰上混匀后转入电转杯中，以时间常数T为6.0、电压为2.5进行电击后，迅速在电转杯中加入1 mL SOC，摇晃孵育1 h后，取100 μL电转产物涂至LB卡那抗性平板，37℃培养过夜。次日挑取单克隆菌落进行纯化培养，获得转化后的菌株。

通过以上方法，先将使用P1/P2引物扩增所得的目的片段转入7455菌株中，通过卡那抗性平板筛选获得菌株7455-aphA。再将pCP21质粒转到7455-aphA菌株中，通过LBA培养基培养获得菌株aphA-pCP21。将质粒pCE40转入菌株aphA-pCP21，通过抗性平板筛选既具有卡那抗性，同时又在麦康凯平板上呈红色的鼠伤寒沙门菌株LT2ΔaphA::lacZ，通过PCR与测序验证正确后，将其命名为ΔaphA::lacZ。

1.3 转导 抽取0.3 mL过夜培养的供体菌菌液加入到2.3 mL P22噬菌体broth中培养8 h后，离心取上清液，加入少量CHCl3灭菌，获得裂解液。

吸取100 μL过夜培养的受体菌菌液与50 μL供体菌裂解液（1∶50）混匀，在相应温度的环境中孵育后，涂布于相应的选择培养基上进行纯化培养，通过PCR进行验证。

将LT2ΔaphA::lacZ作为供体菌，通过以上方式将ΔaphA::lacZ区域分别转入鼠伤寒沙门菌GcvB基因缺失株（基因型ΔgcvB::cat）、鼠伤寒沙门菌GcvB R1基因缺失株（基因型ΔgcvB R1::cat）、鼠伤寒沙门菌GcvB R2基因缺失株（基因型ΔgcvB R2::cat）、鼠伤寒沙门菌GcvB R3基因缺失株（基因型ΔgcvB R3::cat）中，通过抗性平板（cat）进行筛选，分别获得LT2ΔaphAΔgcvB::cat、LT2ΔaphA△R1::cat、LT2ΔaphA△R2::cat、LT2ΔaphA△R3::cat菌株。

1.4 β-半乳糖核苷酸实验 对构建的菌株进行β-半乳糖核苷酸实验：将待测菌株置于相应的环境中过夜培养，次日取100 μL过夜菌液培养至OD600值为0.3～0.5，取0.1 mL菌液置于试管中，以Z buffer定容至1 mL，使用巴斯德吸管加入1滴甲苯，立即旋转振荡30 s，置于42℃摇床中振荡培养2 h，再置于28℃水浴锅中孵育5 min。在试管中加入0.2 mL ONPG（4 mg/mL）反应，记录加入时间（start time，t0）。当试管中出现黄色，加入0.1 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应，记录终止时间（finish time，tf）。将试管中液体离心后取上清液1 mL置于比色皿中，以Z buffer作为空白对照，测OD420，记录数值。

1.5 qPCR试验 根据DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并以此为模板进行PCR扩增，扩增体系为：上、下游引物各1 μL，2×Taq DNA Master Mix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，DNA模板4 μL。扩增条件为：95℃预变性30 min；95℃变性5 s，60℃退火30 s，共35个循环。

将提取的相应菌株的总RNA样本反转录为cDNA后作为模板，参考SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明进行两步法反应。扩增条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共39个循环，每个样本3个重复。对样本数据采用2-ΔΔCt法计算相关基因mRNA的转录水平，即Fold change。

2 结果

2.1 转化构建菌株结果 以拟LT2ΔaphA::lacZ作为模板，采用特异性引物P3/P4对aphA基因进行扩增，将胶回收产物送测序。通过测序结果的峰图与序列，确定成功构建了沙门菌菌株LT2ΔaphA::lacZ（图1），lacZ的序列从aphA的ATG开始39个碱基后进行替换，采用aphA ATP进行β-半乳糖甘酶蛋白的翻译表达。

图1 LacZ替换aphA部分Fig.1 LacZ replaces the aphA section

2.2 转导构建结果 以LT2ΔaphAΔgcvB::cat、LT2ΔaphA△R1::cat、LT2ΔaphA△R2::cat、LT2ΔaphA△R3::cat为模版，使用特异性引物P3/P4进行lacZ片段的扩增，使用特异性引物P5/P6对GcvB片段进行扩增。由琼脂糖凝胶电泳结果可知，PCR扩增出了相应目的片段，确认成功构建出相应的沙门菌缺失菌株。

图2 PCR扩增电泳图Fig.2 PCR results

2.3 β-半乳糖苷酶（lacZ）酶活性测定 将菌株LT2ΔaphA::lacZ、LT2ΔaphAΔgcvB::cat、LT2ΔaphAΔR1::cat、LT2ΔaphAΔR2::cat、LT2ΔaphAΔR3::cat进行β-半乳糖苷酶（lacZ）酶活性测定试验，结果见图3。以ΔaphA::lacZ作为对照组（100%），试验菌株β-半乳糖苷酶酶活均有所增加，分别为：LT2ΔaphAΔgcvB::cat（145.53%），LT2ΔaphAΔR1::cat（244.47%）、L T 2 Δa p h AΔ R 2::c a t（2 3 0.6 7%）、L T 2 Δa p h AΔ R 3::c a t（3 0 5.0 6%），除LT2ΔaphAΔgcvB::cat（145.53%）外，其余菌株变化均显著。而相对于GcvB全缺失菌株LT2ΔaphAΔgcvB::cat，GcvB单一区域缺失的菌株LT2ΔaphAΔR1::cat、LT2ΔaphAΔR2::cat、LT2ΔaphAΔR3::cat变化均显著。

图3 β-半乳糖苷酶酶活测定结果Fig.3 Determination of β-galactosidase enzyme activity

2.4 缺失部分对aphA转录水平的影响 以菌株wt、LT2ΔgcvB::cat、LT2△R1::cat、LT2△R2::cat、LT2△R3::cat作为模版，提取相应菌株的RNA，以特异性引物进行qPCR，结果见图4。将wt（即沙门菌标准株LT2）作为对照组（100%），试验菌株中的a p h A均有所下调，分别为：LT2ΔgcvB::cat（48.17%）、LT2ΔgcvB R1::cat（22.93%）、LT2ΔgcvB R2::cat（22.94%）、LT2ΔgcvB R3::cat（22.17%）。相对于全缺失GcvB菌株LT2ΔgcvB::cat，GcvB单一区域缺失的菌株LT2ΔaphAΔR1::cat、LT2ΔaphAΔR2::cat、LT2ΔaphAΔR3::cat变化极显著。

图4 不同缺失后的STM4351相对转录量Fig.4 The relative transcription of STM4351 after di ff erent deleted

3 讨论

在当前，关于sRNA调控的研究大多为大通量的分析或调控因子的研究，而根据sRNA调控的方式，以单个基因作为目标进行分子水平研究，能使调控机理的研究更为深入具体。在革兰氏阴性菌中，sRNA能与伴侣蛋白Hfq协同作用，将通过与靶mRNA的5'非翻译区（5' UTR）进行不完全互补序列的碱基配对而发挥作用[15]。而sRNA对靶mRNA的调控机制主要为偶联降解、催化降解、闭塞、激活[16]。在偶联降解中sRNA与mRNA进行碱基配对后，sRNA与靶mRNA都被降解，mRNA的水平就出现下降的情况；而催化降解中，sRNA只是起催化作用，靶mRNA会被降解而sRNA则不被降解；激活则如哈维弧菌和霍乱弧菌显示aphA mRNA受到了群体调控小RNA（Qrr sRNA）的调控，aphA mRNA约200 nt长的5' UTR会自发形成掩盖其核糖体结合位点的抑制性结构，不能进行B类酸性磷酸酶翻译，而Qrr sRNAs可以通过伴侣蛋白Hfq辅助碱基配对与aphA mRNA的5' UTR直接进行碱基配对，打开抑制性结构，暴露核糖体结合位点，与核糖体进行结合，从而激活aphA的产生[17-18]。在沙门菌中，翻译会从形成由30S核糖体亚基组成的起始复合物开始，该复合物与mRNA的核糖体结合位点起始因子结合起来，随后结合50S核糖体，形成具有翻译活性的70S核糖体复合物。GcvB sRNA在大多数情况下，与靶基因的5' UTR进行不完全的互补序列，碱基配对干扰了30S核糖体亚基的结合，从而阻断翻译起始，达成对目的基因调控[19]。

如果sRNA缺失后，靶基因所翻译的蛋白，即β-半乳糖苷酶活性出现显著性变化时，会认为sRNA能对靶基因产生调控作用。本研究以沙门菌标准株LT2作为对照组，当GcvB sRNA缺失后，aphA ATG起始的β-半乳糖苷酶活性却没有出现显著性变化，在mRNA水平上，aphA的转录量却出现一定的下降。那么GcvB似乎并不能够对aphA进行调控，但有与aphA mRNA进行结合的可能。将目前GcvB进行调控的R1、R2、R3单区分别缺失后，aphA转录水平出现了降低，β-半乳糖苷酶活性上升了230%～305%。GcvB R1、R2、R3缺失显示出了对aphA的调控作用。针对这种现象，推测GcvB中可能存在调控aphA的区域，在通常情况下R1、R2、R3会联合抑制其对aphA的调控，而缺失某一片段后，抑制作用消失，呈现了对aphA的调控作用；也可能是因为aphA参与了沙门菌的群体感应，GcvB能抑制或激活细菌相关基因的表达，维持细菌的稳定，当其缺失导致细菌生长环境发生变化，aphA转录量也出现了变化，而R1、R2、R3缺失能使反馈到GcvB的信号不发生作用，导致aphA表达量发生变化。本研究确定了GcvB与aphA的表达有一定的联系，为进一步阐述GcvB在STM LT2中的调控机制奠定了基础，但其具体的机制还需进一步研究。

在鼠伤寒沙门菌野生型菌株LT2中，完整的GcvB能影响aphA的mRNA转录量，而当GcvB sRNA中R1、R2、R3缺失后能够对aphA有抑制作用。本研究为沙门菌中的sRNA后续研究及沙门菌的防治奠定了一定基础。