猪瘟病毒微滴式数字PCR方法的建立

高晓龙，王英超，李 月，沈光年，刘晓冬，周德刚，梅 力，冯小宇

（1.北京市动物疫病预防控制中心，北京102600；2.北京市兽药监察所，北京102629）

猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高度接触性传染病。其在家猪和野猪中广泛传播，严重威胁猪养殖业，被世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，OIE）列入OIE疫病名目[1]，为必须申报的法定传染病，也是我国农业农村部规定的一类传染病[2]。

近年来，我国猪瘟病毒的感染病例多呈现非典型性临床症状和病理剖检变化，其典型特征与当下我国广泛流行的非洲猪瘟极其相似，表现为发热、全身广泛性小点出血、便秘腹泻、脾梗死等。因此，必须通过实验室诊断进行鉴别。目前已有的检测方法包括ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）、环介导等温技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[3]、重组酶扩增酶检测技术（recombinase polymerase amplification，RPA）[4]等，但以上方法均存在灵敏度不够，出现假阳性或假阴性的情况。

数字PCR( digital PCR，dPCR）属于第3代PCR，最早出现于1999年[5]，其中微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术是近年来广泛用于标准物质定量的核酸检测技术。与传统的qPCR相比，ddPCR通过统计学原理直接给出浓度，其结果不再依赖于Ct值[6]，避免了在低拷贝数、细微模板浓度差异中灵敏度和精确度的缺陷，能够实现绝对定量。Yan等[7]采集了10个感染H7N9的患者不同治疗时期的样本，分别进行qPCR及ddPCR检测，发现对于qPCR阴性的样本，ddPCR仍可以检测出病毒的存在，说明ddPCR的灵敏度远高于qPCR。ddPCR不仅可以对病原体定性，而且还能对病原体DNA或RNA序列进行绝对定量，从而对疾病进行早期诊断、药物疗效观察、病情判断及预后观察，目前dPCR技术已广泛的应用于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）、艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、甲型流感病毒等临床领域[8]。

本研究建立并优化了猪瘟病毒微滴式数字PCR的绝对定量方法，为猪瘟病毒的早期诊断、实时监测和科学研究提供了一种新的检测手段。

1 材料与方法

1.1 标准品和临床样品 猪瘟病毒C株（CSFV C株）购自中国兽医药品监察所；猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）JXA1株、LV株，圆环病毒2型（Porcine circovirus virus 2，PCV2），伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV），猪细小病毒（Porcine parvovirus virus，PPV），猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV）均由北京市动物疫病预防控制中心保存；50份临床样品中，猪全血样品18份、猪组织样品32份，均由北京市动物疫病预防控制中心保存。

1.2 试剂 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes、Droplet Generation Oil for Probe购自伯乐公司；AMV酶、SuperScriptTMⅢ酶购自北京全式金公司；猪瘟病毒（CSFV）通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒购自世纪元亨公司；引物探针由英潍捷基有限公司合成。

1.3 引物探针设计 根据CSFV 5' UTR基因保守区，分别在首部、中部、尾部设计了3套引物探针（表1），探针5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记BHQ1荧光淬灭基团。从中筛选出通用性好，拷贝数高的引物探针。

表1 本研究中使用的引物探针Table 1 Primers and probes used in this study

1.5 病毒核酸提取 根据病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取核酸，置于-80℃备用。

1.6 ddPCR方法的建立 通过对反转录条件、PCR条件的优化，建立ddPCR方法，并对该方法的线性及最低检测限进行测定。反转录酶可选择AMV酶、SuperScriptTMⅢ酶、One-Step RT-ddPCR Kit for Probes试剂盒中Reverse transcriptase。引物浓度设置为600 nmol/L、900 nmol/L、1200 nmol/L，探针浓度设置为150 nmol/L、250 nmol/L、350 nmol/L，退火温度设置为55℃、57℃、60℃、62℃。反应体系为：One-step ddPCR supermix 5 µL，Reverse transcriptase 2 µL，300 mmol/L DTT 1 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各1.8 µL，探针（10 µmol/L）0.5 µL，ddH2O 7.7 µL，模板2 µL。扩增条件为50℃ 20 min；95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃～62℃1 min，40个循环；4℃ 60 min。

1.7 灵敏性试验 为评估所建立的CSFV ddPCR检测方法的线性关系、扩增效率、灵敏性，将猪瘟病毒（CSFV C株）标准毒株的核酸，10倍倍比稀释（100～104），进行ddPCR检测，每个浓度做3个重复。

1.8 特异性试验 提取PRRSV JXA1、PRRSV LV、PCV2、PRV、PPV、PEDV和TGEV 7种病毒的核酸，使用已经优化的CSFV ddPCR方法分别对其进行检测。

1.9 重复性试验 使用所建立的CSFV ddPCR对同1份样品重复测定10次，确定方法的重复性。

1.10 临床样品检测 使用已经优化的CSFV ddPCR方法和qPCR方法（GB/T 27540-2011）分别对50份临床组织样品进行检测，比较检测结果。

2 结果

2.1 引物探针选择 根据伯乐公司One-Step RT-ddPCR Kit for Probes试剂盒操作说明中ddPCR反应体系，开展CSFV不同引物探针的ddPCR试验，确定CSFV ddPCR方法的引物探针（图1）。上游引物F：5'-GTCAGTAGTTCGACGTGAGCA-3'，下游引物R：5'-AGCACCCTATCAGGTCGTAC-3'，探针P：5'-FAM-ATGCCCAAGACACACCTTAACCCTRGCBHQ-3'。

图1 CSFV ddPCR引物探针选择Fig.1 Primers and probes of CSFV for droplet digital PCR

2.2 ddPCR方法的建立 确定反转录酶为One-Step RT-ddPCR Kit for Probes中的Reverse transcriptase（图2A），引物终浓度为900 nmol/L，探针终浓度为250 nmol/L（图2B），退火温度为55℃（图2C）。

图2 CSFV ddPCR条件优化Fig.2 Optimization of CSFV droplet digital PCR

2.3 ddPCR灵敏性试验 对猪瘟病毒（CSFV C株）标准毒株的核酸10倍倍比稀释（100～104）后进行ddPCR检测，获得微滴生成图（图3）和标准曲线（图4）。CSFV ddPCR标准曲线为y=-1.0766x+4.3965，R2=0.9989，线性关系良好。当检测浓度低于10拷贝以下时能稳定检出且CV值为5.91%，当检测浓度低于1 copy/µL时，也能稳定性检测出，最终确定该方法最低检测下限为3.2 copies/µL。

图3 CSFV ddPCR梯度稀释微滴生成图Fig.3 Droplet generation plot of gradient dilution for CSFV droplet digital PCR

图4 CSFV ddPCR 标准曲线Fig.4 Standard carve for CSFV droplet digital PCR

2.4 ddPCR特异性试验 通过优化后的 CSFV ddPCR检测方法检测其他7种病毒。结果表明ddPCR扩增的微滴数均在10 000以上，试验成立。仅有CSFV孔出现阳性微滴，其余各孔均为阴性微滴（图5）。

图5 CSFV ddPCR 特异性试验Fig.5 Specificity experiment for CSFV droplet digital PCR

2.5 ddPCR重复性试验 同1份样品用ddPCR重复检测10次（图6），变异系数为3.9 %（表2）。表明所建立的CSFV ddPCR检测方法重复性良好。

表2 CSFV ddPCR重复性试验数据Table 2 Data of repeatability experiment for CSFV droplet digital PCR

图6 CSFV ddPCR重复性实验结果Fig.6 Repeatability experiment for CSFV droplet digital PCR

2.6 临床样品检测 应用本试验建立的CSFV ddPCR方法和CSFV qPCR方法（GB/T 27540-2011）分别对50份临床样品（猪全血样品18份、猪组织样品32份）进行检测。结果显示，采用CSFV ddPCR方法检出阳性样品8份，阴性样品42份，与采用CSFV qPCR方法检测结果一致，结果符合率为100%。

表3 临床样品检测结果Table 3 Detection result of field samples

3 讨论

随着防疫技术和检测手段的发展，多数国家已经彻底消灭了猪瘟病毒，但是在我国猪瘟病毒仍然存在。目前在猪瘟防治过程中，猪瘟兔化弱毒疫苗起关键的作用，但在强制免疫的情况下，猪瘟病毒感染的情况仍旧存在。目前，猪瘟在临床上多表现为亚急性、非典型性感染，使得猪瘟病毒早期诊断难以进行，对于病毒载量较低的病例，传统的实验室诊断方法难以判断，因此，建立高灵敏度的核酸检测方法对猪瘟病毒的诊断具有重要意义。

在猪瘟病毒核酸检测技术的早期研究中，姚俊[9]建立的猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量 PCR方法的检测灵敏度为1×102copies/μL，岳峰等[10]建立的TaqMan实时荧光定量PCR的最低检测限是10 copies/μL，高飞等[11]建立的基于TaqMan探针的猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的最低检测限亦是10 copies/μL。本研究建立的微滴式数字PCR的最低检测限为3.2 copies/µL，其灵敏度可达到单拷贝。灵敏度也称为分辨率，对目标基因或突变均有识别能力。该方法在读取结果时仅判断阳性或阴性，受扩增效率的影响降低，对背景序列和抑制物的耐受能力提高，不依赖检测的Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量[12]。

本研究通过对已知的临床样品进行检测，其结果和实时荧光定量PCR方法的检测结果完全一致，实现了对病毒浓度较低或需要绝对定量样品的检测。同时也为猪瘟中长期的防控监测和流行病学研究提供了更加精准科学的方案。