乳酸菌发酵苹果汁工艺研究

高代代,冉军舰,赵功玲,阮晓莉,刘剑桥,段旭

（河南科技学院食品学院,河南新乡453003）

乳酸菌是能够利用糖类,发酵产物主要为乳酸的革兰氏阳性菌的总称,呈杆状或球状[1].乳酸菌能够通过多种生物代谢途径在人体内发挥生理功能,如维持对人体有益的肠道菌群结构平衡,促进肠道对营养大分子的分解和吸收,增强机体免疫力,抗癌和抗肿瘤,延缓衰老,降低胆固醇的作用[2].除此之外,乳酸菌在食品应用中能够通过发酵产生独特的风味物质,受到广大群众的喜爱,在开发新型功能性食品中发挥着重要的作用.

我国苹果资源比较丰富,但是苹果饮料相对较少,通过乳酸菌发酵可以改变苹果的风味,增加营养价值,延长保存期,满足不同人群对苹果的需求[3].并且乳酸菌发酵在丰富营养价值的同时还可以产生特殊的风味物质,如醇、醛、酸、酯和硫化物等[4-7].除此之外,苹果果皮作为一种天然的抗氧化物具有很强的抗氧化活性,与果肉以及同类的果蔬相比,苹果果皮的抗氧化性能更高,这可能是由于苹果果皮中含有较丰富的表儿茶素、原花青素等酚类物质[8-10].

苹果汁营养丰富、益于健康、是人体获得维生素和矿物质等营养补给的重要来源之一.除含有大量水分外,蛋白质、脂质和碳水化合物占有较大比例.目前,发酵型苹果汁属于新兴的饮品,这种饮品营养价值较高,不仅能够改善苹果汁的口感和功效,还可利用这种发酵技术进行护肤品的生产研制[11].与西方国家相比,我国在苹果汁的发酵工艺还不够完善,因此发展我国苹果汁发酵技术迫在眉睫[12].

以红富士苹果为主要原料,利用四种混合乳酸菌来混合发酵苹果汁,在单因素试验的基础上应用响应面优化发酵工艺.本文以期为发酵果蔬饮料研发提供新思路和技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：红富士苹果（糖度质量分数11%、pH值4.42）、伊利百利包、蔗糖购自世纪华联超市;嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnos us）均为河南科技学院食品学院食品生物技术实验室保藏菌株.

试剂：磷酸氢二钾、抗坏血酸、乙酸钠、鱼蛋白胨、乳糖、酒石酸钾钠、硫酸锰等均为分析纯.

1.2 仪器与设备

Model PHS-3C pH计,上海盛磁仪器有限公司;SW-CJ-1D单人单面垂直送风净化工作台,苏州智净净化设备有限公司;JYZ-E5V九阳原汁机,九阳股份有限公司;ZHWY-211恒温培养振荡器,智城分析仪器制造有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 苹果汁的制备 苹果清洗去核后切成果肉小丁榨汁,加入少量的抗坏血酸防止发生酶促褐变,置于转速为2 000 r/min的离心机中离心15 min,上清液置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌15 min,冷冻待用（-20℃）.

1.3.2 菌种的活化 将所需菌种划线37℃恒温培养,挑取单菌落于MRS液体培养基中37℃震荡培养16 h.以2%的接种量相同条件再次活化,作为试验发酵种子液[13].

1.3.3 菌种驯化活化菌液→牛奶苹果汁(m牛奶∶m苹果汁=9∶1)→培养→牛奶苹果汁(m牛奶：m苹果汁=7∶3)→培养→牛奶苹果汁(m牛奶：m苹果汁=5∶5)→培养→牛奶苹果汁(m牛奶：m苹果汁=3∶7)→培养→牛奶苹果汁(m牛奶：m苹果汁=1∶9)→培养→纯苹果汁→培养[14]

1.3.4 发酵剂的制备 驯化后的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌以质量分数为3%的接种量分别接入到含有50 mL苹果汁的250 mL锥形瓶中,37℃恒温环境中以200 r/min的转速培养12 h;嗜酸乳杆菌按质量分数为3%的接种量接入到50 mL的苹果汁中,37℃恒温环境中培养12 h;嗜热链球菌按照质量分数为3%的接种量接入到50 mL的苹果汁中,40℃恒温环境中培养12 h[15].

1.3.5 苹果汁发酵工艺流程 在1.3.1苹果汁制备的基础上,确定乳酸菌发酵苹果汁的工艺流程,工艺流程如下：

1.3.6 单因素试验 参照1.3.5苹果汁发酵工艺流程,将苹果汁和无菌水共50 mL置于250 mL锥形瓶中,蔗糖1.5 g[16],接种配比为1∶1∶1∶1.

1.3.6.1 苹果汁添加量的确定 在一定发酵温度、发酵剂接种量和发酵时间下,将苹果汁按照质量分数为15%、20%、25%、30%、35%的比例,添加到无菌水中进行发酵,测定不同苹果汁的添加量对发酵苹果汁感官评分的影响.

1.3.6.2 发酵温度的确定 在苹果汁的添加量、发酵剂的接种量和发酵时间一定的条件下,分别在25、30、35、40、45℃下发酵,测定不同发酵温度对发酵苹果汁的感官评分的影响.

1.3.6.3 发酵剂接种量的确定 在苹果汁添加量、发酵时间和发酵温度一定的条件下,分别接种质量分数为1%、2%、3%、4%、5%的发酵剂,测定发酵剂的不同接种量对发酵苹果汁的感官评分影响.

1.3.6.4 发酵时间的确定 在苹果汁添加量、发酵温度和发酵剂接种量一定的条件下,分别发酵25、30、35、40、45 h,测定不同发酵时间对发酵苹果汁的感官评分影响.

1.3.7 响应面优化试验 根据单因素试验结果,采用Box Behnken模型,以果汁添加量（A）、发酵温度（B）、发酵剂的接种量（C）、发酵时间（D）为自变量（分别以-1,0,1代表自变量的中、低、高3个水平）；以感官评分为响应面值,选择苹果汁发酵的最佳条件[17].

1.3.8 苹果汁感官评定标准 感官评定采用评估检验法,评定小组对成品进行评分,总分100分.取平均分作为感官评定的结果.评定细则见表1.

表1 感官评分细则Tab.1 Detailed rules for sensory scoring

1.4 数据处理分析

每组试验重复3次,单因素方差分析采用SPSS 19.0软件;以P＜0.05为显著性检验标准.

1.5 测定方法

1.5.1 pH值测定 使用Model PHS-3C型pH计测定.首先对pH计进行校准,取100 mL发酵的苹果汁倒入锥形瓶中加热煮沸10 min（排出CO2）,自然冷却,转移至100 mL容量瓶定容.将pH计两电极插入待测苹果汁,按下读数开关,稳定1 min,pH计指针所指pH值即为果汁饮料pH值[18].

1.5.2 还原糖含量测定 采用直接滴定法[19]测定发酵产品中的还原糖含量.取出待测发酵苹果汁除去蛋白质,以亚甲基蓝作为指示剂,在加热条件下滴定碱性酒石酸铜溶液,根据消耗的体积计算还原糖含量.

1.5.3 乳酸菌活菌计数 活菌计数采用倾注平板计数法测定[20].首先制备苹果汁的质量浓度梯度.适当稀释样品分别移入平皿中,注入46℃营养琼脂,进行三个重复,然后将平板放在37℃培养48 h,测菌落数.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 苹果汁添加量对发酵苹果汁感官品质的影响 苹果汁添加量对发酵苹果汁感官品质的影响结果见图1.

图1 苹果汁添加量对发酵苹果汁感官评分的影响Fig.1 Effect of apple juice addition on sensory evaluation of fermented apple juice

由图1可知,苹果汁添加量在15%～35%范围内,随着苹果汁添加量的增加,发酵苹果汁的感官评分先升高后降低.当苹果汁添加量为30%时,发酵苹果汁的感官评定最高,由此确定成品的理想果汁添加量为30%.

2.1.2 发酵温度对发酵苹果汁感官品质的影响 发酵温度对发酵苹果汁感官品质的影响结果见图2.

图2 发酵温度对发酵苹果汁感官品评分的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation of fermented apple juice

由图2可知,发酵温度在25～35℃范围内,随着发酵温度的升高,发酵苹果汁的感官评分先升高后降低势.当发酵温度为35℃时,发酵苹果汁的感官评定最高,由此确定成品的理想发酵温度为35℃.

2.1.3 发酵剂接种量对发酵苹果汁感官品质的影响 发酵剂接种量对发酵苹果汁感官品质的影响结果见图3.

图3 发酵剂接种量对发酵苹果汁感官评分的影响Fig.3 Effect of inoculum amount on sensory evaluation of fermented apple juice

由图3可知,发酵剂的接种量在1%～5%范围内,随着发酵剂接种量的增加,发酵苹果汁的感官评分先升高后降低.当发酵剂接种量为2%时,发酵苹果汁的感官评定最高,由此确定成品的理想发酵剂接种量为2%.

2.1.4 发酵时间对发酵苹果汁感官品质的影响 发酵时间对发酵苹果汁感官品质的影响结果见图4.

图4 发酵时间对发酵苹果汁感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of fermented apple juice

由图4可知,发酵时间在25～45 h,随着发酵时间的增长,发酵苹果汁的感官评分先升高后降低.当发酵时间为35 h时,发酵苹果汁的感官评定最高,由此确定成品的理想发酵时间为35 h.

2.2 响应面法优化工艺

2.2.1 优化结果与方差分析 将表2数据运用Design-Expert 8.0.6进行统计分析,得到感官评分（Y）对苹果汁添加量（X1）、发酵温度（X2）、发酵剂接种量（X3）、发酵时间（X4）的回归方程为：Y=-588.83+10.09X1+9.27X2+4 2.61X3+18.42X4+0.11X1X2+0.50X1X3-005X1X4-0.24X2X3+0.06X2X4-0.21X3X4-0.22X12-0.20X22-10.29X32-0.27X42.由回归方程可知,发酵剂接种量对成品感官评分影响最大.

表2 响应面试验设计及数据处理Tab.2 Response surface test design and data processing

（续表2）

感官评分的方差分析见表3.

表3 感官评分的方差分析Tab.3 Analysis of variance of sensory score

由表3可知,模型P＜0.000 1,说明影响显著,失拟项为0.339 8,说明干扰因素影响不显著.模型决定系数R2为0.987 4,说明响应值的实际值和预测值间拟合度较好,可用于分析预测产品的最优工艺.通过方差分析可发现：X4、X1X2、X1X3、X2X4、X12、X22、X32、X42均呈极显著影响（P＜0.01）,X3、X1X4、X2X3呈显著影响（P＜0.05）,其它项不显著.就影响程度而言,发酵时间＞发酵剂接种量.

2.2.2 各因素交互作用分析 各因素交互作用对感官评分影响的响应面图见图5.

图5 各因素交互作用对感官评分影响的响应面图Fig.5 Response surface diagram of the interaction of factors on sensory score

由图5可知,感官评分随着各因素的增加先升高后降低.其中发酵时间对感官评分的影响最大.图5A、5B、5C、5D、5E等高线形状为椭圆形,说明交互作用显著.图5F等高线形状为圆形,表明二者交互作用不显著,与方差分析结果一致.

2.2.3 验证性试验结果 优化后最佳工艺为苹果汁添加量质量分数为30%,发酵温度35℃,发酵剂接种量质量分数为2%,发酵时间34 h,在该条件下感官评分预测值为83.32分.为验证该结果,在此条件下进行5次试验得到感官评分为82.44±0.25分,与预测值接近.因此通过响应面方法得到的最佳工艺条件较可靠.

2.3 测定结果

采用最优配方发酵苹果汁,测定其pH值、还原糖、活菌数、结果见表4.

表4 发酵后测定结果Tab.4 Determination results after fermentation

3 结论

本文利用嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵苹果汁,通过单因素试验结果确定响应面试验的因素水平,以感官评定为检测指标,得到发酵产品的最佳工艺条件：苹果汁添加量质量分数为30%,发酵温度35℃,发酵剂接种量质量分数为2%,发酵时间35 h.得到产品的感官评分82.44分,pH值为3.45,糖度质量浓度5.5%,活菌数6.64×108CFU/mL.