常规体外受精与卵泡浆内单精子注射中异常受精胚胎形成的影响因素分析

王金鸾 张宁 李婷婷

(山东中医药大学中医学院，山东 济南 250014)

在常规体外受精(IVF)和卵胞浆内单精子注射(ICSI)过程中，正常胚胎的形成受到精卵质量、实验室的培养环境等多种因素影响，胚胎形成过程中任何环节出现错误都可能会造成异常受精胚胎的出现。异常受精是指受精过程中未观察到雌雄两个原核(2PN)，受精卵出现原核数目的异常，包括未见原核(0PN)、单原核(1PN)、多原核(≥3PN)[1]。在实验室胚胎观察过程中，精卵结合后出现异常受精的胚胎通常不作为移植的首选胚胎，甚则直接遗弃此类胚胎，不仅造成胚胎的浪费，同时高异常受精率给高龄、卵巢功能减退等患者也带来巨大的经济、生理以及心理负担[2]。本研究通过Logistic回归分析分析常规IVF/ICSI中可能导致异常受精胚胎形成的影响因素，以期提高临床上卵母细胞的利用率，减少胚胎浪费。

1 材料与方法

1.1 材料来源

回顾性分析2019年1月—2020年5月就诊于山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心的IVF/ICSI助孕的1 018个周期患者的临床资料。按照是否有异常受精将患者分为异常受精组(n=871)和对照组(n=147)，其中异常受精组至少出现1个非双原核(2PN)的受精卵。纳入标准：女方年龄≥20岁；夫妇染色体正常；女方免疫学检查正常。排除标准：短时受精的患者；严重遗传性疾病患者；供精、供卵患者；获卵数为0的患者。

1.2 控制性超促排卵(COH)方案

根据患者的具体情况选择常规的黄体期长方案或者拮抗剂方案。黄体期长方案：在前次月经的黄体中期注射半支长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-α，达菲林，规格3.75 mg/支，法国博福-益普生制药有限公司)降调节，垂体达到降调标准[雌二醇(E2)的水平<50 ng/L，黄体生成激素(LH)的水平<5 U/L，子宫内膜厚度<4～5 mm，无功能性囊肿]后使用促性腺激素(Gn)，注射重组卵泡刺激素(FSH，果纳芬，规格450 U，瑞士默克雪兰诺有限公司；或普丽康，规格600 U，美国默沙东公司)或人绝经期促性腺激素(HMG，规格75 U，珠海丽珠集团丽珠制药厂)促排卵，根据阴道超声下卵泡数目、大小和血清性激素水平确定Gn的起使剂量。当患者2～3个主导卵泡直径达18～20 mm时，肌内注射10 000 U人绒毛膜促性腺激素(hCG，珠海丽珠集团丽珠制药厂)进行扳机，36 h左右行阴道超声引导下穿刺取卵术。拮抗剂方案：月经第2～3天根据患者情况使用Gn 75～300 U启动，阴道超声监测卵泡发育情况，从主导卵泡直径达12～14 mm时开始每天加用GnRH拮抗剂0.25 mg(思则凯，规格0.25 mg/支，瑞士默克雪兰诺有限公司)直至hCG日，扳机后取卵。

1.3 授精及胚胎评价

实验室胚胎受精方式(IVF/ICSI)结合患者自身情况加以选择。IVF适应证：①女方因各种因素导致的配子运输障碍；②排卵障碍；③子宫内膜异位症；④男方少、弱精子症；⑤不明原因不孕；⑥免疫性不孕。ICSI适应证：①严重的少、弱、畸精子症；②不可逆的梗阻性无精子症；③生精功能障碍；④免疫性不育；⑤体外受精失败；⑥精子顶体异常。取卵当日男方手淫法取精后，采用上游法优化处理精子。取卵4～6 h后按照常规IVF/ICSI的操作方式进行授精，16～18 h后观察原核及极体的出现情况，依此判断受精情况。

1.4 观察指标

①女方年龄：按照年龄分为20～30、31～35、≥36岁；②基础FSH(bFSH)：按照bFSH的水平分为<10 U/L、≥10 U/L；③基础E2(bE2)：按照bE2水平分为<25、25～45、>45 ng/L；④体质量指数(BMI)：按照中国人BMI分级标准分为<24、≥24 kg/m2；⑤用药治疗方案：包括黄体期长方案、拮抗剂方案；⑥男方前向精子运动率(PR)：按照男方PR分为<32%、≥32%；⑦人绒毛膜促性腺激素(hCG)日E2：按照hCG日E2的水平分为<2 000、2 000～3 000、>3 000 ng/L；⑧实验室受精方式：包括常规IVF、ICSI。将上述资料进行比较分析，研究其与异常受精胚胎形成的相关性。

1.5 统计学方法

使用SPSS 25.0统计软件分析数据。计数资料以例(χ/%)表示，单因素分析采用χ2检验，异常受精胚胎形成的影响因素采用二分类多因素Logistic回归分析进行分析。所有分析均为双侧检验，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 异常受精胚胎形成影响因素的单因素分析

单因素分析结果表明，两组女方年龄、bFSH、bE2、用药方案、精液PR率、hCG日E2水平、实验室受精方式比较，差异具有统计学意义(χ2=6.674～74.908，P<0.05)；两组的BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 异常受精胚胎形成影响因素的单因素分析[例(χ/%)]

2.2 异常受精胚胎形成影响因素的多因素Logistic回归分析

将是否存在异常受精胚胎作为因变量(无=0，有=1)，将上述单因素分析有统计意义的因素作为自变量，纳入Logistic回归模型进行多因素分析。变量赋值如下：①女方年龄：20～30岁=0，31～35岁=1，≥36岁=2；②bFSH水平：<10 U/L=0，≥10 U/L=1；③bE2水平：<25 ng/L=0，25～45 ng/L=1，>45 ng/L=2；④用药方案：拮抗剂方案=0，黄体期长方案=1；⑤精液PR率：<32%=0，≥32%=1；⑥hCG日E2水平：<2 000 ng/L=0，2 000～3 000 ng/L=1，>3 000 ng/L=2；⑦实验室受精方式：常规IVF=0，ICSI=1。结果显示，女方年龄≥31岁、hCG日E2水平>3 000 ng/L是异常受精胚胎形成的危险因素；黄体期长方案、ICSI的受精方式是异常受精胚胎形成的保护因素(P<0.05)。见表2。

表2 异常受精胚胎形成影响因素的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

随着临床医疗水平的提高和辅助生殖技术的发展进步，IVF、ICSI的成功率逐年上升，但辅助生殖技术中胚胎的多精受精率仍达2%～10%[3-5]。在临床实践中，0PN、1PN、≥3PN胚胎临床利用率低，与2PN胚胎相比，其发育异常可能性更高[6]。一部分生殖中心对于无可利用2PN胚胎的患者，会选择0PN胚胎进行移植。有文献报道称，0PN胚胎的囊胚形成率为16.7%，其中包含44.4%的正常染色体胚胎[7]，说明0PN来源的胚胎移植理论上具有一定的可实施性。赵双丹等[8]研究发现，0PN+2PN移植组的种植率与临床妊娠率均显著低于2PN移植组，考虑0PN来源的胚胎存在一定的遗传缺陷，应谨慎用于临床移植。1PN胚胎的形成机制主要与孤雌激活[9]和两个原核过早融合相关[10-11]。相关研究发现，IVF中1PN来源胚胎的囊胚养成率显著低于2PN来源胚胎(14.8%与36.4%)，ICSI则分别为6.6%和34.0%[12]。≥3PN胚胎的形成与染色体异常密切相关，包括复杂嵌合体、三倍体等[13]。临床研究发现，与正常受精胚胎相比，异常受精胚胎细胞碎片率高、发育速度慢、潜能差[6,13]。在临床诊疗中，医生应首选2PN胚胎进行移植，若无2PN来源胚胎时，0PN/1PN胚胎可作为备选胚胎，经患者充分知情同意后选择性进行移植。

异常受精的发生与卵子成熟障碍、精卵结合异常等诸多因素相关。本研究单因素分析结果显示，女方年龄、bFSH、bE2水平、用药方案、精液PR率、hCG日E2水平、实验室受精方式均与异常受精胚胎的出现具有显著相关性，而进一步采用多因素Logistic回归分析表明，女方年龄≥31岁、hCG日E2水平>3 000 ng/L是异常受精胚胎形成的危险因素；黄体期长方案、ICSI的受精方式是异常受精胚胎形成的保护因素。

女性年龄对卵母细胞质量有重要影响，年龄越大，卵巢储备功能及卵子质量越差，优质卵子率及优质胚胎率越低，可利用胚胎数减少，妊娠率及活产率均受影响[14-15]。有研究表明，高龄女性因卵母细胞质量下降，线粒体的数量减少及功能减退，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成减少，供能不足，影响细胞减数分裂，造成胚胎异常受精率升高[16]。本研究发现，女性年龄≥31岁是异常受精的相关危险因素，高龄造成女性卵子不可逆老化，而卵子老化对卵母细胞胚泡产生率及囊胚形成率均有影响，无法支持正常受精的发生[17]。

卵母细胞在受精过程中释放的皮质颗粒可预防多精受精的发生，不成熟的卵母细胞其皮质颗粒功能不足，易增加多精受精的发生概率[18]。本研究结果显示，异常受精组的hCG日E2水平明显高于正常受精组，hCG日E2水平>3 000 ng/L是异常受精胚胎形成的危险因素。hCG日E2水平升高可增加获卵数，提高卵子成熟率。但有报道称HCG日的高E2水平会影响卵母细胞质量，可能与补充外源性Gn后出现卵巢高反应相关[19]。ANDERSEN等[20]研究发现，辅助生殖技术中外源性Gn的使用易造成卵母细胞发育代谢异常、胞核与胞质发育不同步等问题，而卵巢高反应在一定程度上加重了卵母细胞的异常，增加了受精异常的发生风险。SANTOS等[21]研究表明，超促排卵可增加卵母细胞的非整倍体率，影响卵母细胞质量。而HCG日高E2水平会造成胚胎发育速度的减缓，降低优质胚胎率[22]。

常规IVF/ICSI受精方式的选择具有其相对应的适应证，不同的受精方式对胚胎的形成发育有一定的相关性。本研究发现，ICSI的受精方式是异常受精胚胎形成的保护因素。有研究表明，与ICSI相比，IVF的多原核受精率明显增高[23]。ICSI授精时会对卵母细胞进行挑选，排除未成熟或过熟的卵子，而IVF为精卵自由结合，卵母细胞发育的同步性受不同促排卵方案的影响，因此精子与不成熟卵子或过熟卵子的结合概率较ICSI增加，故多原核受精率升高。张亚楠等[24]研究发现，与IVF相比，ICSI的0PN及1PN胚胎发生率更低，体外受精方式是形成0PN及1PN胚胎的重要影响因素，与本研究结果相一致。

本研究结果表明，黄体期长方案是异常受精胚胎形成的保护因素。黄体期长方案应用GnRH激动剂抑制垂体的反应性，使得自身分泌的FSH、LH减少，卵泡的发育主要依赖于外源性Gn，卵泡发育同步性较好，成熟度也较为一致。近年来拮抗剂方案凭借其治疗时间短、费用少的优势，临床应用较为广泛[25]。拮抗剂方案应用GnRH拮抗剂竞争性结合垂体的GnRH受体，对自身分泌的FSH、LH抑制较轻，卵母细胞发育受内源性Gn与外源性Gn的共同影响，其发育的同步性明显变差，可能影响卵母细胞的成熟度，导致未成熟卵子、过熟卵子与精子结合，造成异常受精胚胎的出现。朱洁茹等[26]研究发现，拮抗剂方案的获卵数、成熟卵子数均显著低于黄体期长方案。LIN等[27]根据hCG日优势卵泡的不同比例将患者分为高、中、低优势卵泡组，GnRH-α长方案中低优势卵泡组(优势卵泡比例<20%)的正常受精率最高，拮抗剂方案中低优势卵泡组的临床妊娠率与高优势卵泡组相比明显降低。同时大数据研究表明，卵巢低反应人群中，拮抗剂方案的使用率为53%，而黄体期长方案的使用率仅为9%，拮抗剂方案的纳入人群存在一定的偏向性，可能影响异常受精的发生[28]。

综上所述，女方年龄、hCG日E2水平、用药方案、实验室受精方式均是常规IVF/ICSI中异常受精胚胎形成的影响因素。本研究为单个生殖中心数据的回顾性分析，缺乏多地区、多中心、大样本量的前瞻性研究数据分析，研究结果可能存在一定的偏倚。但对临床工作的开展仍有一定的提示意义，临床工作者应了解形成异常受精胚胎的影响因素及其危害性，结合患者情况综合判断，采取相应的预防及治疗措施，提高卵母细胞利用率，为减少胚胎浪费、降低异常受精胚胎发生率提供指导。