红曲菌发酵对低盐半干鲩鱼的提味增鲜作用

吴 康，谢静晖，王倩倩，齐 明，吴建中,*

（1.暨南大学理工学院，广东 广州 510632；2.佛山职业技术学院汽车工程学院，广东 佛山 528137）

鲩鱼别名草鱼，饲料来源广、生长迅速，肉质嫩而不腻，营养丰富，深受消费者的喜爱，是中国淡水养殖的四大家鱼之一[1-2]。商品鲩鱼通常1～5 kg，肉厚刺少，除以鲜活鱼销售外，还适合加工成咸鱼，但传统咸鱼盐分高、肉质硬，不符合现代消费需求。近年来市场出现的低盐半干鱼的盐分和水分适中，是传统咸鱼的换代产品，将鲩鱼加工成低盐半干鱼具有广阔的市场前景[3]。但低盐半干鱼由于用盐量低，干燥时间短，缺少了传统腌制工艺中的自然接种和自然发酵，其口感接近于新鲜鱼，缺失了传统咸鱼的醇厚口感。

通过人工微生物接种可以改善半干鱼和咸鱼等鱼产品的口感与品质。著名的徽菜“臭鳜鱼”就是典型的发酵鱼；周长艳等[4]在传统腌制鱼上接种乳酸菌，结果表明：发酵鱼产品咸度、挥发性盐基氮以及过氧化值都明显降低，保留了传统腊鱼的口感与香腊味；高继庆等[5]利用木糖葡萄球菌发酵海鲈鱼，结果表明，鱼肉硬度、咀嚼性、胶黏性明显增加，小分子肽和氨基酸含量明显上升；明庭红等[6]利用植物乳杆菌发酵草鱼，结果表明：草鱼肉中的主要腥味物壬醛和2,4-癸二烯醛等逐渐减少，香味物质D-柠檬烯和1-辛烯-3-醇等明显升高。本课题组将红曲菌发酵技术引入低盐半干鱼工艺，制作出的产品色香味俱佳，不仅具有传统咸鱼的“腊香味”，而且滋味明显比普通半干鱼更加鲜美。

鲜味是食品五大基本味觉之一，也是深受人们喜爱的美味之一[7]，目前国内外关于发酵鱼的研究大多集中在制备工艺和笼统的风味方面，而关于发酵鱼中鲜味物质含量和组成的研究较少报道。鉴于红曲菌发酵对半干鲩鱼具有明显的提味增鲜作用，为揭示其中原因，分别制备红曲菌发酵型半干鱼及其对照品，分别对样品进行感官评价，测定其水可溶性氮（water soluble nitrogen，WSN）、三氯乙酸可溶性氮（tricholoracetate acid soluble nitrogen，TCA-SN）、游离氨基酸（free amino acids，FAA）、肌苷酸（guanosine 5′-monophosphate，5′-IMP）和鸟苷酸（inosine 5′-monophosphate，5′-GMP）的含量，计算出滋味活性值（taste activity value，TAV）和味精当量（equivalent umami concentration，EUC），通过分析红曲菌发酵对半干鲩鱼鲜味成分的影响，找出其规律，旨在为进一步优化半干鱼滋味打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

仙泉湖牌鲜泉鲩鱼购买于华润万家超市；GIM3.439紫红曲菌购于广东省微生物菌种保藏中心。17 种氨基酸混和标准品 美国Sigma公司；AMP标准品、GMP标准品 上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 天津光复精细化工研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HZQ-X100A恒温振荡培养箱、电热鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司；YXQ-手提式压力蒸汽灭菌锅上海华线医用核子仪器有限公司；无菌操作台 苏州安泰空气技术有限公司。LC-20A高效液相色谱 日本岛津公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；热泵干燥设备为实验室自制。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及其制备

红曲菌种子液：1）斜面培养：取活化后的红曲菌菌种，接入121 ℃高压灭菌后的PDA试管斜面，30 ℃培养7～10 d；2）扩大培养：将米粉6 g、大豆蛋白2.5 g、硫酸镁0.1 g、磷酸二氢钾0.05 g、蒸馏水100 mL混匀，高压灭菌后得到红曲菌扩大培养基，然后吸取5 mL无菌水注入斜面中，振摇15 min，将红褐色的孢子洗入灭菌后的红曲菌扩大培养基中，于35 ℃、150 r/min摇床培养5 d，得到深红色均匀的红曲菌种子液。

红曲菌发酵剂：按照米-水比例10∶9在大米中加入蒸馏水，蒸熟后，放置超净工作台中冷却至室温得大米培养基，取无菌水、红曲菌种子液、大米培养基按3∶4∶20比例接入大米培养基，并搅拌均匀，30 ℃培养2 d得到深红色的红曲米，打浆得红曲菌发酵剂。

普通半干鱼制备：将鲩鱼去鳞、头、尾、鳍和内脏，用水冲洗干净，并切成3 cm×6 cm的小块，向其中添加3%的食盐，4 ℃干腌2 h，然后转移至热泵干燥器中，在27 ℃、湿度20%的条件下干燥至鱼体水分质量分数为50%左右，真空包装后即为普通半干鱼组成品。

红曲菌发酵鱼制备：将鲩鱼去鳞、头、尾、鳍和内脏，用水冲洗干净，并切成3 cm×6 cm的小块，向其中添加3%的食盐，4 ℃干腌2 h后，采用在容器中滚揉涂布的方式接种红曲菌发酵剂，接种量为9%，然后在30 ℃发酵18 h，最后转移至热泵干燥器中，在27 ℃、湿度20%的条件下干燥至鱼体水分质量分数为50%左右，真空包装后即为红曲菌发酵组成品。

添加灭活发酵剂半干鱼制备：将鲩鱼去鳞、头、尾、鳍和内脏，用水冲洗干净，并切成3 cm×6 cm的小块，向其中添加3%的食盐，4 ℃干腌2 h后，采用在容器中滚揉涂布的的方式添加经高温灭活的红曲菌发酵剂，添加量为9%，然后转移至热泵干燥器中，在27 ℃、湿度20%的条件下干燥至鱼体水分质量分数为50%左右，真空包装后即为添加灭活发酵剂组成品。

1.3.2 感官评价

将干燥结束后的鱼块蒸煮15 min，每次挑选10 名暨南大学食品系教师及学生，分别对成品进行感官评定，采用评分检验法进行打分，感官评价标准依照表1[8]。

表1 感官评定标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of low-salt semi-dried fish

1.3.3 TCA-SN的测定

参考Visessanguan等[9]的方法。取鱼肉3 g，加入27 mL 10% TCA溶液，均质2 min后冰浴1 h，10 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min并取上清液。通过凯氏定氮法测定TCA-SN含量。

1.3.4 WSN的测定

参照Sun Weizheng[10]的方法。称取3 g样品，加入15 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH 6.0，50 mmol/L），研磨2 min，4 ℃放置2 h，冷冻离心（10 000 r/min，15 min），快速过滤后取10 mL上清液进行消化，其他步骤同凯氏定氮法。

1.3.5 FAA的测定

参考刘登勇等[11]的方法，并作适当修改，在50 mL离心管中加入约4 g鱼肉样品和20 mL 50 mg/mL磺基水杨酸，均质2 min。将均质后的混合液4 ℃、10 000 r/min离心15 min。取上清液加纯水定容到50 mL，将水相过0.22 μm膜，用氨基酸自动分析仪检测。样品采用柱后茚三酮在135 ℃条件下衍生，记录440 nm和570 nm波长处的吸光度。每种氨基酸的定量通过其与氨基酸标准品的峰面积比较确定。通过比较氨基酸标准物的保留时间和峰面积定量样品中氨基酸的种类和数量。

1.3.6 5′-IMP、5′-GMP的测定

提取：参考Kong Li等[12]的方法，略有改动。取鱼肉5 g加入20 mL 10%的高氯酸溶液，研磨，然后10 000 r/min离心15 min，取上清液，沉淀用10 mL 5%的高氯酸溶液洗涤，离心取上清液，用10 mol /L和1 mol/L的KOH溶液调pH值至6.5，静置30 min，取上清液加纯水定容至50 mL。摇匀，过0.22 μm膜后测定。整个过程在0～4 ℃条件下操作。

色谱条件：高效液相色谱仪色谱柱：SUPELCO DiscoveryR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钾（pH 5.16）；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL；检验波长254 nm；分析时间17 min。

采用外标法定量分析，配制GMP和IMP混标溶液，质量浓度分别为10、20、30、40、50 mg/L。以质量浓度（mg/L）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

1.3.7 TAV的计算

TAV是样品中滋味活性物质含量与其呈味阈值的比值。通过FAA、呈味核苷酸和有机酸含量计算出相应的TAV，找出对鱼肉滋味有显著贡献的成分。当TAV大于1时，认为该物质对呈味有贡献，而TAV小于1时认为该物质对呈味没有贡献，由此可以确定主要的呈味物质[13]。

1.3.8 EUC的计算

EUC衡量呈现谷氨酸钠盐滋味活性的氨基酸类（谷氨酸（Glu），天冬氨酸（Asp））与5′-核苷酸整体对食品鲜味的贡献[14]。如下式所示：

式中：ai为鲜味氨基酸（Glu或Asp）含量/（g/100 g）；bi为鲜味氨基酸相对于味精（monosodium glutamate，MSG）的相对鲜度系数（Glu为1；Asp为0.077）；aj为呈味核苷酸（5′-IMP、5′-GMP）含量/（g/100 g）；bj为呈味核苷酸相对于IMP的相对鲜度系数（5′-IMP为1；5′-GMP为2.3）；1 218是协同作用常数。

1.3.9 细菌总数测定

参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[15]。

1.3.10 挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值测定

根据GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》中的微量扩散法测定[16]。

1.4 数据处理

数据采用Excel 2007软件进行整理，采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析，结果以表示，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 感官评价分析

表2 3 组半干鱼产品的感官评价得分Table 2 Sensory evaluation scores of three groups of semi-dried fish products

将3 种半干鱼产品随机编码后，按表1随机进行感官评定，结果如表2所示。红曲菌发酵组产品的滋味和气味显著优于其他2 组（P＜0.05），但普通半干鱼和添加灭活发酵剂组产品的气味没有显著性差别。红曲菌发酵组产品的色泽显著优于其他2 组（P＜0.05），但其质构与其他2 组没有显著性差别。从综合评分上看，红曲菌发酵组产品得分最高，普通半干鱼组次之，添加灭活发酵剂组最低。这可能是由于发酵过程中蛋白质降解而产生了大量多肽和FAA及其进一步代谢产物，这些物质赋予其独特鲜味口感和特殊发酵风味[17]。

2.2 TCA-SN、WSN的比较分析

图13 组半干鱼产品中TCA-SN、WSN的含量Fig. 1 Contents of TCA soluble nitrogen and WSN in three groups of semi-dried fish products

由图1可知，添加灭活发酵剂组产品中的TCA-SN从普通半干鱼组的（3.474±0.306）mg/g显著提高到（4.085±0.015）mg/g（P＜0.05）。另一方面，红曲菌发酵组TCA-SN含量明显高于添加灭活发酵剂组产品（P＜0.05），表明产品在发酵过程中出现了大量蛋白质降解现象，小肽类物质含量明显增加。

WSN与TCA-SN含量呈现同样规律，红曲菌发酵组WSN含量最高，其次是添加灭活发酵剂组，最后是普通半干鱼组，综上所述，红曲菌发酵剂中含有一定量的小肽、FAA等含氮物质；在普通半干鱼上接种红曲菌发酵剂，经过一段时间发酵后，产品中的蛋白质被大量降解，导致小分子肽和FAA的含量明显增加[18-19]。

2.3 FAA的比较分析

由表3可知，除Arg外，添加灭活发酵剂组中各种FAA含量均显著高于普通半干鱼组，鲜味氨基酸和总游离氨基酸也显著增加（P＜0.05），表明红曲菌发酵剂中含有一定量的FAA。另一方面，红曲菌发酵组与添加灭活发酵剂组产品相比，总游离氨基酸含量从（489.50±7.66）mg/100 g显著增加到（779.69±10.02）mg/100 g（P＜0.05），除Ser、His、Arg外，其他FAA含量均增加，尤其是Asp、Glu、Met、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe，其含量增加超过3 倍，其中Asp和Glu为典型的鲜味氨基酸，赋予发酵鱼独特鲜味[20]，同时，芳香氨基酸（Phe）、支链氨基酸（Leu、Ile、Val）和Met是许多重要风味化合物的前体物质[21]。

表3 3 组半干鱼产品FAA含量Table 3 Contents of free amino acids in three groups of semi-dried fish products mg/100 g

2.4 呈味核苷酸的比较分析

表4 3 组半干鱼产品中核苷酸质量浓度Table 4 Contents of nucleotides in three groups of semi-dried fish products mg/mL

半干鱼产品的独特滋味不仅与游离呈味氨基酸有关，还与呈味核苷酸密切相关，一般认为，GMP和IMP具有突出的鲜味，是食品工业中常用的鲜味剂[22]。由表4可知，添加灭活发酵剂组产品中5′-GMP、5′-IMP含量显著高于普通半干鱼组（P＜0.05），尤其是GMP含量增加了5 倍以上。此外，红曲菌发酵组与添加灭活发酵剂组鱼产品相比，5′-GMP、5′-IMP含量显著增加（P＜0.05），表明红曲菌发酵过程能有效促进三磷酸腺苷的降解，有助于提升肉质的鲜味。

2.5 滋味物质的呈味作用和鲜味强度评价

滋味物质的呈味作用不仅取决于呈味物质的浓度，还与呈味物质的阈值有关[23]。由表5可知，与普通半干鱼组及添加灭活发酵剂组相比，红曲菌发酵半干鱼中5′-GMP、Glu的TAV值均大于1，导致发酵鱼的鲜味更加突出，与Lys、His一起构成了红曲菌发酵鱼的主要滋味贡献物质，其中His能够使发酵鱼的口感更加醇厚。

表5 3 组半干鱼产品中滋味物质的含量 、滋味特征、阈值和TAVTable 5 Thresholds and TAVs of taste compounds in three groups of semi-dried fish products

图2 半干鱼产品的EUCFig. 2 EUCs of three groups of semi-dried fish products

EUC是基于FAA与呈味核苷酸之间协同作用对鲜味进行评价的方法，这种分析方法被广泛应用于食品鲜味特征的研究[27]。如图2所示，红曲菌发酵组产品中EUC值最高，为7.34 g/100 g，其次为添加灭活发酵剂组产品中EUC值为1.51 g/100 g，普通半干鱼组EUC值最低，为0.20 g/100 g。红曲菌发酵半干鱼中EUC值是添加灭活发酵剂组的4.38 倍，因此红曲菌发酵半干鱼的鲜味程度的得到极大提高。

2.6 红曲菌发酵对样品总菌数的影响

由图3可知，3 组样品的总菌数从高到低的顺序是：红曲菌发酵组、普通半干鱼组和添加灭活发酵剂组。红曲菌发酵组显著高于普通半干鱼组（P＜0.05），其中原因是经过发酵后，红曲菌的数量增加。实验中还发现添加灭活发酵剂组的总菌数低于普通半干鱼的总菌数（P＜0.05），推测红曲菌发酵剂虽然经过灭活，仍然具有一定抑菌作用[28]，抑制了半干鱼中微生物的生长。

图3 半干鱼产品的总菌数Fig. 3 otal bacterial counts of three groups of semi-dried fish products

2.7 红曲菌发酵对样品TVB-N值的影响

图4 半干鱼产品的挥发性盐基氮Fig. 4 TVB-N values of three groups of semi-dried fish products

TVB-N值是评估鱼肉制品新鲜度和卫生性的重指标[29]。由图4可知，虽然在30 ℃发酵了18 h，红曲菌发酵组TVB-N值仅稍高于普通半干鱼组和添加灭活发酵组（P＜0.05），此时红曲菌发酵组TVB-N值仍远低于25 mg/100 g的安全标准（GB 1036—2015《动物性水产制品》）[30]。

3 结 论

红曲菌发酵后的半干鱼产品滋味更加鲜美醇厚，色泽红润诱人；红曲菌发酵半干鱼样品中WSN、TCA-SN含量显著增加；总FAA，特别是Glu和Asp等鲜味氨基酸的含量明显增加，5′-GMP和5′-IMP等呈鲜核苷酸含量也明显提高。红曲菌发酵半干鱼样品中5′-GMP与Glu的TAV均大于1，表明该两成分对产品鲜味味贡献程度大。红曲菌发酵半干鱼样品的EUC达到7.34 g/100 g，是添加灭活发酵剂组鱼样品的4.38 倍，表明红曲菌发酵后的低盐半干鲩鱼鲜味得到明显增强。经过红曲菌适度发酵的半干鲩鱼，其TVB-N值能够控制在安全范围，但鲜味氨基酸和核苷酸含量显著增加，滋味更加鲜美。