‘印度青’苹果合成与分解代谢通量研究及贮藏温度的优化

袁 帅，鲁丁强，庞广昌

（天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

现如今低温贮藏和化学保藏是我国水果保鲜的两个主要技术手段[1]，它们作为传统的保鲜方法技术成熟，并且随着不断研究，优点更加明显的生物保鲜技术逐渐成为新兴的现代保鲜方法[2-3]。但无论利用哪种技术手段，保鲜的目的都是为了延长水果寿命、延缓腐败，从本质上来讲就是保持水果生命活动的情况下，最大限度地减少其分解代谢[4-6]。代谢是生物体不断进行物质、能量和信息交流过程所形成的网络，生物体内各种酶则控制着代谢网络有序进行[7]。温度是影响酶活性及代谢作用最重要的因素之一[8]，低温保鲜技术成为水果保鲜中应用最广泛研究最成熟的一种方法，但是在贮藏过程中温度对代谢影响的研究则比较少[9]。

保证生物体的一切生命活动的是能量，这种能量主要以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的形式存在。在分解代谢过程中一方面经过糖酵解产生的丙酮酸在有氧条件下通过三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环产生ATP；另一方面中间代谢物脱氢产生NADH和H+，通过递氢体将其中的氢质子和电子传递给氧生成水，并通过氧化磷酸化提供能量。TCA循环与氧化磷酸化都在线粒体中进行，两种产能方式都需要充足的氧气，但当机体内供氧不足时，代谢中产生的丙酮酸与NADH、H+只能在乳酸脱氢酶催化下生成乳酸。研究表明，乳酸盐不仅与中心代谢途径相偶联，还可以通过乳酸穿梭作用，作为一种信号分子影响细胞甚至机体全身的代谢，并对诸多合成与分解代谢过程（如细胞呼吸作用、氧化磷酸化、糖异生等）起到关键的调节作用[10-12]。水果贮藏过程中没有营养供给，延长贮藏期就需要尽量减少能量消耗即减少分解代谢。呼吸作用本质上就是氧化磷酸化，因此抑制呼吸作用即可以减少分解代谢，从而达到水果保鲜的目的。乳酸盐作为调节呼吸作用中的一种关键物质，在贮藏保鲜中也发挥重要作用[13]。

水果保鲜在延长贮藏时间的同时也需要保证果实品质，糖分构成是影响果实品质的重要因素[14-15]，直接影响着果实口感、风味等特征，多种糖分中蔗糖尤其重要[16-18]。只有既延长水果的贮存时间又不影响其口感品质的贮藏温度才是最适贮藏温度。因此，减少糖类的分解代谢损耗，增加蔗糖的合成代谢，在水果贮藏中尤为重要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘印度青’苹果（Malus pumilaMill.）于天津果园采摘，选取外观完整无损伤、无病虫害、大小质量相似、成熟度一致的苹果作为实验材料。

4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、1,3-二磷酸甘油酸（1,3-diphosphoglycerate，1,3-BPG）、二羟基苯乙酮（dihydroxyacetophenone，DHAP） 美国Sigma公司；蔗糖比色法检测试剂盒武汉伊莱瑞特生物科技公司。

1.2 仪器与设备

3K15高速冷冻离心机 美国Sigma公司；J2-21高速冷冻离心机 美国Beckman公司；HVE-50高压灭菌器日本Hirayama Manufacturing公司；SBA-40C生物传感器分析仪 山东省科学院生物研究所；Fluoroskan Ascent FL荧光-化学发光检测仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将采摘后的‘印度青’苹果进行清洗擦干后放置于生化培养箱中，以本实验室前期研究结果[19]作参照，设置0、2、5、10、15、20、40 ℃ 7 个温度梯度，分别贮藏24 h（‘印度青’苹果在贮藏24 h之后可以达到在该温度下的一种稳定的代谢状态[9]）。实验共需21 个苹果，每个温度设3 个平行，待贮藏24 h后取出，从中间部位横截平面切开，从外向内进行取样，将‘印度青’苹果按图1分为4 个部位，并分别标记为部位1、部位2、部位3、部位4[13]，其中部位1为果皮层，部位2、3为果肉层，部位4为果核层，除果皮层外，每层取2 cm厚度，果皮层只取外周果皮及相连少许果肉。将取的样品立即用液氮冷冻防止氧化，并在液氮条件下研磨匀浆，最后将匀浆液全部转移入离心管，以10 000×g、4 ℃离心10 min，收集上清液，并于-80 ℃条件贮藏。

图1 ‘印度青’苹果4 个部位分布图Fig.1 Schematic diagram of four parts of ‘Indian Green’ apples sampled

1.3.2 ‘印度青’苹果乳酸盐和蔗糖代谢网络图的构建

根据代谢网络的研究方法及代谢网络的构建原则[20]，选择糖酵解途径、磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）、TCA循环和蔗糖合成途径为主要代谢途径来构建代谢网络，代谢过程中的多个中间代谢反应使得网络图过为复杂，因此将直线反应进行合并，将不在研究范围内的代谢途径忽略，减少构建的代谢网络中代谢反应数目，从而得到简化的蔗糖乳酸盐代谢网络图（图2）。

图2 蔗糖、乳酸盐代谢网络图Fig.2 Sucrose and lactate metabolic networks

表1 蔗糖、乳酸盐代谢反应方程式[9]Table 1 Sucrose and lactate metabolic reaction equations[9]

表2 蔗糖、乳酸盐代谢反应的质量平衡方程[9]Table 2 Metabolic flux model equations of sucrose and lactate metabolic reactions[9]

根据图2将代谢网络图中的代谢反应方程式提取出来（表1），在整个蔗糖乳酸盐代谢网络中，有12 个需要测定的代谢速率（r1～r12），根据代谢网络通量分析的原则[20]，由胞内中间代谢产物G6P、F6P、G3P、Pyr、Ac-CoA、G1P、UDPG、SUC-6-P可确定的质量平衡方程有8 个（表2）。假定胞内中间途径的代谢物的量都处于拟稳态，也就是这8 个途径代谢物在机体内的稳态环境状态下没有积累，它们的质量平衡方程都为0，就可以得到关于12 个代谢速率的8 个约束向量；此时该系统的自由度F＝4。而代谢产物系统中的NADH的代谢速率（P＝r9-r10+r11+r12）可通过实验测得，乳酸盐（Lac）代谢速率r10、蔗糖（Suc）代谢速率r7和葡萄糖（Glu）代谢速率r1也可以通过实验测定的，因此可以得到唯一解，进而通过计算方程得到蔗糖和乳酸盐的通量[21]，从而计算出所构建的代谢网络图中的每一条代谢途径的通量。

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1.3.3 葡萄糖、乳酸盐、NADH和蔗糖含量的测定

不同贮藏温度的‘印度青’苹果不同部位中葡萄糖和乳酸盐的含量通过生物传感器分析仪测定，蔗糖含量的测定通过蔗糖比色法检测试剂盒测定。NADH含量的采用荧光-化学发光检测仪通过酶法进行测定，具体参考文献[22-24]的方法，其反应体系为0.25 mmol/L HEPES/EDTA缓冲液、100 mmol/L KCl、10 mmol/L MgSO4、3 mmol/L 1,3-二磷酸甘油酸、0.5 mmol/L DHAP、0.4 U/mL GAPDH。再按照文献[20]的方法，得到代谢网络图中葡萄糖、蔗糖、乳酸盐、NADH的通量，由于通量为单位时间与速率的乘积，而实验中贮藏时间是一致的，因此速率结果可近似看作通量结果，由此得到了r1、r7、r10、P。

1.4 通量系数矩阵的计算

使用Matlab软件以及SPSS软件进行数据处理，通过表2质量平衡方程将各个中间代谢物所对应方程的系数提取出来（例如G6P系数为1，-1，-1，-1，0，0，0，0，0，0，0，0），建立一个系数矩阵G[20]（式（1）），该矩阵行表示可以用于拟稳态假设的8 个中间代谢物以及可测定的NADH，即9 个约束向量；列表示代谢模型中包括的12 个生化反应，矩阵中的数值则表示相应的化学计量系数。V表示r1～r12速率向量的方向矩阵。

整个体系处于拟稳态下，通过矩阵G和矩阵V可以将总体化学计量方程表示出来，具体见式（3）。

对公式（3）进行求解时，首先将G拆解成两个子矩阵，第一个是已知终产物通量（r1、r7、r10、P）的系数矩阵，第二个是剩余未知中间代谢物通量的系数矩阵；然后将第二个矩阵进行负逆矩阵处理后与第一个矩阵相乘得到一个新矩阵G’。再用G’代替G，将G’、V代入公式（3）并进行变形可得到公式（4）。将r1、r7、r10、P的数值代入公式（4），可求得其他反应速率，即各个反应的通量，从而得到‘印度青’苹果蔗糖乳酸盐代谢通量网络图。

2 结果与分析

2.1 ‘印度青’苹果不同部位蔗糖、乳酸盐代谢网络通量图的分析结果

图3 ‘印度青’苹果不同部位蔗糖、乳酸盐通量图Fig.3 Sucrose and lactate flux in different parts of ‘Indian Green’ apples

由实验测得7 个不同温度（0、2、5、15、20、40 ℃）下贮藏的‘印度青’苹果蔗糖、葡萄糖以及乳酸盐的代谢速率，将其带入平衡方程，即可得到‘印度青’苹果蔗糖和乳酸盐代谢网络通量图（图3）。从代谢通量网络图中可以看出，在整体趋势下，不同贮藏温度下的‘印度青’苹果蔗糖和乳酸盐代谢通量有明显不同，并且在同一温度下不同部分的蔗糖和乳酸盐代谢通量也有较大区别。由图3A可知，在部位1中，在2 ℃的条件下进入PPP的通量比其他6 个温度均少，在该温度下更多地流向糖酵解和蔗糖合成途径；由丙酮酸分支来看，中间温度（5、10 ℃和15 ℃）进入TCA循环途径的通量较多，有氧呼吸较强。苹果作为呼吸跃变型果实，在果实成熟后存在着一个呼吸高峰，当温度适宜，即温度在5、10 ℃和15 ℃时，苹果呼吸作用会增强，而当温度降低时，呼吸作用明显降低。

由图3B可知，在部位2中，2 ℃和5 ℃对比其他温度进入PPP途径的通量较少，其他温度都有较高PPP途径通量，0 ℃下进入PPP的通量甚至超过总通量的一半。再观察丙酮酸分支，0 ℃时进入TCA循环途径通量较少，而在5、10 ℃和15 ℃温度下进入TCA循环通量大，说明这3 个温度下有氧呼吸较强。

由图3C可知，在部位3中，2 ℃条件下进入PPP途径的通量甚至变为负值，在网络图中可认为该处反应反向进行，并且该温度下进入蔗糖途径的通量明显高于其他温度；20 ℃和40 ℃下进入PPP的通量远多于其他温度。对于丙酮酸分支，依然遵循着中间温度（5、10 ℃和15 ℃）进入TCA循环途径的通量高于其他4 个温度。

由图3D可知，在部位4中，2 ℃和15 ℃两个温度下进入PPP途径的通量较少，这说明这两个温度下合成其他物质如核酸、蛋白质等的能力降低，反而进行蔗糖合成反应增加。再观察丙酮酸分支，0 ℃下进入TCA循环途径的通量略高于2 ℃，但总体依旧呈中间温度（5、10 ℃和15 ℃）有氧呼吸强度高，低温（0 ℃和2 ℃）与高温（20 ℃和40 ℃）有氧呼吸强度低的特征。

总体来说，苹果作为呼吸跃变型果实，在适宜温度下（5、10 ℃和15 ℃）会出现明显的呼吸高峰，有氧呼吸增强，从而使得其分解代谢增强不利于贮存。随着温度的降低，有氧呼吸也会逐渐减弱，但并不是温度越低呼吸越弱，在0 ℃时，由于温度过低而导致机体内酶活力降低，从而引起冷应激[25]，增加分解代谢提供能量，加大酶表达量来维持生命活动，使得有氧呼吸增强，不利于贮藏。在不同温度下，‘印度青’苹果进入TCA循环途径的通量都大于乳酸盐通量，即有氧呼吸在不同温度、不同层区中都是主要的呼吸方式。

2.2 ‘印度青’苹果不同部位蔗糖代谢通量的分析结果

糖分构成是影响果实品质的一个重要的因素[26]，现有研究表明，苹果果实中糖分的积累受韧皮部卸载、跨膜运输、碳水化合物代谢及相关酶活性等方面的调控[27]，其中蔗糖是参与苹果果实中糖卸载的一种重要物质，并且还是细胞代谢的调节因子[28]，可能通过影响基因表达发挥作用；因此蔗糖在与苹果品质形成有关的代谢中起着重要作用[29]。

图4 不同温度下‘印度青’苹果4 个部位的蔗糖通量Fig.4 Sucrose flux in four parts of ‘Indian Green’ apples at different storage temperatures

从图4可以看出，2 ℃时蔗糖通量明显高过其他温度，且此温度下果肉部分（部位3与部位2）的蔗糖通量高于其他部位。按照温度变化来看，部位1～4蔗糖通量的方差分别为：4.257、7.376、8.626和2.250，可以看出部位4即靠近果核部位蔗糖通量变化最小，最稳定，对温度变化不敏感。部位2、3即果肉部位蔗糖通量受温度影响大，并且在2 ℃时出现最大值，显然该温度下利于葡萄糖流向蔗糖这一代谢途径。蔗糖作为苹果中一种重要的糖分构成，对苹果贮藏期各种代谢物的协调交流起着重要作用[16]，同时也影响着果实的品质。因此降低葡萄糖的分解代谢，增加蔗糖的合成代谢就意味着可以延长苹果的贮藏时间。综上，2 ℃时蔗糖合成的通量更多，是‘印度青’苹果更合适的贮藏温度。

2.3 ‘印度青’苹果不同部位乳酸盐代谢通量的分析结果

乳酸盐可以通过单羧酸运载体在组织、细胞中穿梭运输[30]，并调节机体合成与分解代谢以及呼吸作用。葡萄糖在细胞内经过糖酵解产生丙酮酸，而丙酮酸则会在线粒体中被彻底氧化产生能量以及水和二氧化碳，但当呼吸作用受到抑制时，丙酮酸会转化为乳酸，并通过乳酸穿梭作用到达机体其他部位而被利用。因此，高的乳酸盐通量可以作为氧化呼吸代谢受限制的标志，也可以说明部分合成代谢的增强。在‘印度青’苹果的贮藏中，需要减少其呼吸作用，从而延长其保存期限。

图5 不同温度下‘印度青’苹果4 个部位的乳酸盐通量Fig.5 Lactate flux in four parts of ‘Indian Green’ apples at different storage temperatures

由图5可以看出，2 ℃条件下乳酸盐通量最高。在生物体内存在着持续的能量、物质交换，这些交换越少说明机体越稳定，存活时间也就越长。‘印度青’苹果在贮藏过程中，表皮接触空气而果核则不能接触空气，这就会使得各个部分之间呼吸作用具有差异，这种呼吸作用差异的出现就会使各个部分间乳酸盐通量产生差异。0、2、5、10、15、20、40 ℃条件下4 个部位乳酸盐通量的方差分别为0.345 1、0.005 2、0.224 9、0.033 4、0.212 6、0.021 8、0.01 31。方差越低说明各个部位间的乳酸盐通量差异越小，呼吸交换越少，状态越稳定，可以看出在2 ℃下方差最小，10、20 ℃和40 ℃方差也都较小，但0、20 ℃和40 ℃下乳酸盐通量低，说明在这3 个温度下，虽然机体到达平衡但处于高呼吸作用下，不利于贮藏。通过乳酸盐通量及其方差综合来看，2 ℃时乳酸盐通量高，且各部位之间差异小，机体处于稳态，有利于限制呼吸作用，从而更好地减小苹果的呼吸高峰值，使贮藏时间延长。

3 讨 论

本研究进行了不同温度下‘印度青’苹果的蔗糖和乳酸盐代谢网络通量分析，结果表明：在2 ℃时‘印度青’苹果的蔗糖合成通量较高，部位1～4分别为32、42、47和33，糖分解代谢水平较低，并且部位2、3蔗糖合成通量最高，使其口感品质在贮藏期间仍维持在较高水平。苹果是典型的呼吸跃变型果实，而乳酸盐在水果的贮藏保鲜中发挥重要作用[31]，它的通量反映了呼吸代谢的受限状态和合成代谢的增强情况，在2 ℃条件下乳酸盐通量在‘印度青’苹果的各个部位都处于较高的水平，部位1～4分别为1.87、1.86、1.86和1.86，此温度下贮藏更有利于降低呼吸代谢，延缓呼吸高峰出现的时间。植物在成长过程中CO2在叶绿体内经过卡尔文循环转化为糖[32]，从而产生糖的累积。而在贮藏阶段，果实中的糖分不能通过光合作用补给，为使‘印度青’苹果长期贮藏依然保持良好口感就需要糖异生的过程，将苹果酸、甘梨醇等转化为糖[33]，通过实验中乳酸盐、蔗糖通量比较，乳酸盐也可能通过糖异生过程转化为蔗糖，降低呼吸作用，使果实产生的乳酸也可能会反馈为蔗糖，从而保持‘印度青’苹果长时间贮藏及良好口感。综合蔗糖代谢通量以及乳酸盐代谢通量可以得出，2 ℃是‘印度青’苹果的最适贮藏温度。这一结论也与诸多品种苹果贮藏温度范围的研究结果[34-36]相一致。实验所得到的结果可为今后水果贮藏保鲜的条件优化提供新的研究思路，并从代谢这一整体角度为水果贮藏保鲜提供新的参考。