黑蒜对溃疡性结肠炎BALB/c小鼠炎症反应的影响

崔晓谕，郑红英，綦占文，林长青，吴笑天，郭建鹏,

（1.延边大学医学院，吉林 延吉 133002；2.延边大学药学院，吉林 延吉 133002；3.延边韩工坊健康制品有限公司，吉林 延吉 133000；4.延边大学融合学院，吉林 延吉 133002）

黑蒜又称黑大蒜、发酵黑蒜，是将新鲜带皮的大蒜经过酶解、熟化和干燥等过程制得[1]。大蒜既是普通食品又是传统中药材，作为药材使用最早见于《名医别录》，《中国药典》收载其功能为解毒、消肿、杀虫、止痢。黑蒜中保留了大蒜原有的大部分成分，并提高了多种微量元素的含量[2]，具有抗菌谱广、杀菌能力强的特点，同时兼具抗肿瘤、抗血小板凝集等多种药理作用[3-4]。

溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一种亚型，是一种影响结肠健康状态的慢性特发性炎性疾病[5]。溃疡性结肠炎患者多表现为大便充血和腹泻，患者长期处于慢性炎症状态，导致肠道菌群失调或营养不良。研究表明，在全世界范围内溃疡性结肠炎的发病率正在增加，已成为一种全球性疾病[6-9]。

目前认为，促炎细胞因子和抗炎细胞因子平衡的失调是溃疡性结肠炎发病的重要机制[10-11]。基于此，溃疡性结肠炎的治疗方法主要包括抗炎和免疫抑制，其主要目的是减轻炎症反应和抑制免疫反应。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是公认的能介导溃疡性结肠炎发病的促炎细胞因子，TNF-α的表达量可以作为反映溃疡性结肠炎疾病严重程度的重要指标[12-14]。现阶段，临床治疗溃疡性结肠炎通常采用美沙拉秦和皮质类固醇等药物，这些药物因其免疫抑制和短期愈合的特性，具有较强的副作用，不适于长期使用。因此，寻求一种副作用小且安全、有效的天然替代品对于炎症性肠病的防治具有重要意义。

此前，已有学者证明了黑蒜具有提高BALB/c小鼠免疫功能的作用[15]。本实验通过葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导小鼠溃疡性结肠炎模型，考察黑蒜对小鼠炎症评价指标的影响，为黑蒜在预防或辅助治疗溃疡性结肠炎中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

健康SPF级BALB/c雌性小鼠，6 周龄，体质量为18～21 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司。实验动物生产许可证号SCXK（辽）2015-0001。

黑蒜 延边韩工坊健康制品有限公司。

DSS（Lot：D5906810） 上海翊圣生物科技有限公司；美沙拉秦缓释颗粒 上海爱的发制药有限公司；米吐尔 上海源叶生物科技有限公司；冰醋酸、过氧化氢溶液 天津市科密欧化学试剂有限公司；TNF-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β检测试剂盒南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、β-actin、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 武汉塞维尔生物科技有限公司；17590-1-AP TNF-α抗体 武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

台式高速冷冻离心机 湖北平凡科技有限公司；Synergy HTX酶标仪 美国Bio-Tek仪器公司；Eclipse Ci显微镜（配备Digital Sight DS-FI2成像系统） 日本Nikon公司；TP-A2000电子天平 福建华志电子科技有限公司；BSA224S电子分析天平 德国Sartorius公司；BV-2垂直电泳仪、BT-2转印电泳仪 武汉塞维尔生物科技有限公司；JY92-11N超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受试物制备及灌胃剂量计算

黑蒜经水提取后，收集提取液，浓缩至料液比1∶1，作为受试物。按照中国成年男女平均体质量70 kg计，根据人体每日推荐剂量计算，设置低、中、高剂量进行动物灌胃实验，分别为成人日摄入剂量的0.5、1、2 倍，计算后灌胃剂量分别为0.39、0.78、1.56 g/（kgmb·d）。

1.3.2 实验动物分组及造模

将36 只BALB/c小鼠适应性喂养7 d后，随机分为6 组：正常组、模型组和黑蒜低、中、高剂量组以及阳性对照组，每组6 只。正常组小鼠正常饮用蒸馏水，其余各组小鼠自由饮水摄入质量分数4% DSS溶液，连续7 d，建立小鼠溃疡性结肠炎模型。造模成功后，黑蒜低、中、高剂量组小鼠分别按0.39、0.78、1.56 g/（kgmb·d）剂量灌胃黑蒜水提取液，阳性对照组小鼠按0.195 g/（kgmb·d）剂量灌胃美沙拉秦缓释颗粒，正常组、模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水。连续灌胃给药10 d。

1.3.3 样本采集

灌胃0～7 d期间，每天采集小鼠粪便留样，进行隐血及血便检测。最后一次灌胃24 h后，小鼠眼球取血，室温下静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，取上清分装，-20 ℃保存待测。取小鼠结肠组织，用生理盐水清洗后滤纸吸干，测量结肠长度后放入装有体积分数10%福尔马林固定液的EP管中。

1.3.4 隐血及血便检测

通过硫酸甲氨基酚法检测血便。取少量小鼠粪便置于玻片中央，滴加10 mg/mL硫酸甲氨基酚-乙酸溶液3 滴，体积分数3%过氧化氢溶液3 滴，立即观察结果[16]。

1.3.5 小鼠一般情况观察及体质量、疾病活动指数测定

实验全程观察小鼠的精神及活动情况，记录体质量并按下式计算体质量变化率。

参照Cooper等[17]的方法按表1所示评分标准计算疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分。

表1 小鼠DAI评分标准Table 1 Criteria for DAI evaluation of mice

1.3.6 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β质量浓度的测定

取一定量小鼠血清，严格按照试剂盒说明书步骤操作，采用酶联免疫吸附法测定TNF-α、IL-6、IL-1β质量浓度。

1.3.7 免疫印迹法检测小鼠结肠组织中TNF-α表达水平

取小鼠结肠中远端组织，用预冷磷酸盐缓冲液冲洗后剪成小块，加RIPA裂解液进行匀浆。匀浆完成后放置冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，收集上清液，通过BCA法测定蛋白浓度。确定蛋白上样量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭后，洗膜3 次分别加入TNF-α抗体（1∶1 000）和β-actin（1∶3 000），4 ℃孵育过夜，洗膜3 次后加入二抗（1∶5 000），常温孵育1 h，洗膜3 次后通过增强化学发光法显色，进行曝光显影可视化处理。

1.3.8 小鼠结肠病理组织观察

最后一次灌胃24 h后，剖取结肠组织，常规取材，脱水，包埋，制片，苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察并描述组织病理学变化，拍摄主要描述中不同种类的病变部位。参照Bergstrom等[18]的方法进行病理组织学评分，评分标准见表2。

表2 小鼠病理组织学评分标准Table 2 Criteria for histopathological evaluation of mice

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 26软件进行数据统计学分析，结果以平均值±标准差表示。多组间采用最小显著性差异法比较，组间比较采用邓肯检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。采用Graphad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠体质量、结肠长度及DAI评分的影响

图1 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠体质量的影响Fig.1 Effect of black garlic on body mass of mice with ulcerative cditis

图2 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响Fig.2 Effect of black garlic on colon length in mice with ulcerative colitis

图3 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠DAI评分的影响Fig.3 Effect of black garlic on DAI score of mice with ulcerative colitis

小鼠造模后出现精神萎靡、毛发无光泽、血便、体质量下降等现象。由图1可知，除正常组外，灌胃期间其余各组小鼠体质量呈不同程度下降，灌胃结束时，黑蒜各剂量组小鼠体质量与模型组差异显著。由图2可知，灌胃结束后，与正常组相比，模型组小鼠结肠长度极显著缩短（P＜0.01）；与模型组相比，黑蒜中剂量组小鼠结肠长度显著增加（P＜0.05），黑蒜高剂量组和阳性对照组小鼠结肠长度极显著增加（P＜0.01），且接近于正常组长度。由图3可知，与正常组相比，模型组小鼠DAI评分极显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，黑蒜低、高剂量组和阳性对照组小鼠DAI评分显著降低（P＜0.05）。

2.2 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理学变化的影响

图4 灌胃黑蒜后溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理学变化（×400）Fig.4 Histopathological changes in the colon of mice with ulcerative colitis after gavage with black garlic (× 400)

图5 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠结肠病理组织学评分的影响Fig.5 Effect of black garlic on histopathological score of colon in mice with ulcerative colitis

由图4可知，与正常组相比，模型组小鼠出现结肠黏膜炎症，隐窝丢失，个别部位黏膜上皮明显变薄，杯状细胞减少。与模型组相比，黑蒜低剂量组小鼠结肠隐窝结构相对完整，仍有部分炎性细胞浸润，无明显差异。黑蒜中、高剂量及阳性对照组小鼠结肠隐窝结构基本完整，炎性浸润较模型组小鼠明显减轻，上皮细胞排列较为紧密，杯状细胞数量较多，这与图5黑蒜中、高剂量及阳性对照组小鼠病理组织学评分极显著低于模型组（P＜0.01）的结果一致。

2.3 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠血清和结肠组织中TNF-α表达的影响

图6 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠血清中TNF-α质量浓度的影响Fig.6 Effect of black garlic on TNF-α concentration in peripheral blood of mice

图7 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中TNF-α相对表达量的影响Fig.7 Effect of black garlic on the relative expression of TNF-α in colon tissue of mice with ulcerative colitis

由图6～7可知，模型组小鼠外周血中TNF-α质量浓度和结肠组织中TNF-α相对表达量极显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，黑蒜各剂量组和阳性对照组小鼠外周血中TNF-α质量浓度和结肠组织中TNF-α相对表达量均下降，并呈现量效关系趋势，其中黑蒜中、高剂量组与模型组差异极显著（P＜0.01）。

2.4 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠IL-1β、IL-6表达的影响

由图8～9可知，模型组小鼠血清IL-1β、IL-6质量浓度极显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，黑蒜各剂量组和阳性对照组小鼠血清IL-1β、IL-6质量浓度均下降，并呈现量效关系趋势，其中，黑蒜低剂量组显著低于模型组（P＜0.05），黑蒜中、高剂量组与模型组相比差异极显著（P＜0.01）。

图8 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠血清IL-1β质量浓度的影响Fig.8 Effect of black garlic on serum IL-1β concentration in mice with ulcerative colitis

图9 黑蒜对溃疡性结肠炎小鼠血清IL-6质量浓度的影响Fig.9 Effect of black garlic on serum IL-6 concentration in mice with ulcerative colitis

3 讨 论

大蒜为百合科葱属多年生草本植物，性味辛、温，具有消炎、抗菌、消毒等功效[4]。高温发酵是大蒜的新型加工技术，发酵过程中发生美拉德反应，使蒜瓣通体呈黑色，故称为黑蒜[19]。发酵过程促使生大蒜中部分蛋白质转化成为氨基酸，容易被人体吸收。黑蒜对恢复体力、增强免疫力及保持健康具有积极作用，与生大蒜相比，黑蒜的抗氧化能力提高了数十倍，且食后无蒜味、味道酸甜，是极具潜力的保健食品原料[20-23]。

截至2015年，全球大约有1 120万 人受到溃疡性结肠炎与克罗恩病影响[24]。每年每10万 人中有1～20 人新发，有5～500 人受到影响[25-26]。溃疡性结肠炎是一种以T细胞浸润结肠为特征的自身免疫性疾病，会导致结肠和直肠的炎症和溃疡，并可能导致一系列并发症，其发病的直接原因尚不明确[27]。

DSS在诱导动物实验性结肠炎中使用广泛，成功率和重复性高，DSS诱导的动物结肠组织损伤与人溃疡性结肠炎病变相似度高，是建立小鼠结肠炎模型的理想方法[28]。黏膜组织检查是明确诊断溃疡性结肠炎，并与克罗恩病相鉴别的主要方法。溃疡性结肠炎的病理特征包括隐窝结构扭曲、隐窝发炎、隐窝脓肿以及固有层出血或出现炎性细胞。越来越多的证据表明，炎症相关因素与溃疡性结肠炎的发病机理密切相关。溃疡性结肠炎发病时，全身性炎症指标可能出现高水平表达，此时可以用血清炎症标志物来量化炎症的程度。目前已发现，黑蒜对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)阳离子自由基均具有良好的清除作用，对脂多糖诱导的RAW264.7细胞生长抑制有显著性保护作用[29]，对NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞炎性因子的释放均有显著抑制作用[30]。黑蒜中有效成分蒜氨酸通过抑制细胞外调节蛋白激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶/过氧化物酶体增殖因子活化受体γ刺激的核因子-κB/AP-1/信号转导与转录激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）活化和p38诱导的STAT1活化，减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎，抑制脂多糖刺激的RAW264.7细胞的炎症反应[31]。

本实验采用DSS建立BALB/c小鼠溃疡性结肠炎模型，造模后小鼠体质量降低，出现稀便和血便等症状。病理组织学可见结肠长度缩短、黏膜损伤、炎症细胞浸润等炎症症状。以上结果提示DSS成功诱导了溃疡性结肠炎模型。给予不同剂量黑蒜干预后，小鼠溃疡性结肠炎症状减轻和病理组织学指标降低，TNF-α、IL-1β、IL-6的质量浓度显著下降。结果表明，黑蒜具有降低BALB/c小鼠溃疡性结肠炎炎症反应的作用。研究结果为黑蒜在预防或辅助治疗溃疡性结肠炎中的应用提供了实验依据。