枣主栽品种酸组分含量动态变化与相关基因表达分析

童盼盼，张亚若 ，梁丰志 ，吴翠云 ，2，王江波 ，2

（1.塔里木大学植物科学学院/南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室，新疆阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

枣（Ziziphus jujubaMill）是鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）植物，是中国重要的干果树种，因其抗旱耐脊且枣果速丰、营养丰富尤其是维生素含量高、入药还可润心肺、益气养容等优点，在促进农民经济发展和改善生态环境方面居于十分重要的地位［1］。据近几年的数据统计显示，全国枣果年产量占世界99%以上，干果产量排名第一［2］。枣作为南疆重要的经济作物，是农民脱贫致富的途径之一，但随着近年来新疆枣产业过剩，提质增效迫在眉睫。枣品质的好坏与枣的糖酸比息息相关，糖酸比是果实中总糖与总酸的比值，可以影响果实的口味、品质以及保质期，同时也是决定枣果实商品价值优劣的重要指标［3］。因此，枣糖酸代谢机制始终是研究者们关注的热点。

有机酸是果实品质的重要组成部分，果实类型不同有机酸组成及其变化也不同，通常以苹果酸［4］、柠檬酸［5］为主，赵爱玲等［6］研究发现枣果实中有机酸主要是苹果酸、奎宁酸和琥珀酸，其中苹果酸含量最高，属苹果酸优势型，而总酸及各组分酸的含量在不同品种间存在极显著差异。张春梅［7］基于全基因组重测序，找到了4 个酸代谢关键基因并发现枣果实有机酸主要为苹果酸，而酸枣果实主要为苹果酸和柠檬酸。陈昕［8］通过研究蛋白质表达模式发现ZjATP-CS1、ZjACO1 和 ZjACO2 是造成酸枣中柠檬酸积累的关键蛋白质，ZjMDH3、ZjMS 和ZjNADPME3 是造成酸枣中苹果酸积累的关键蛋白质。马倩倩［9］研究发现在枣果实发育过程中，ZjCS 相对表达量的变化趋势与柠檬酸含量的变化趋势基本一致，柠檬酸的积累主要受ZjCS 的正调控作用，在酸枣果实中，苹果酸的积累主要受NAD-MDH 酶催化，又受到ZjMdh 的正调控作用。前人已经初步阐明了枣和酸枣果实糖酸风味差异的分子机制。但目前对影响枣主栽品种果实发育时期酸组分含量变化及相关基因差异研究尚无报道，还需深入系统研究。

为了填补这方面的空缺，明确枣主栽品种果实发育时期主要酸组分含量变化与相关基因差异，本试验以冬枣、灰枣和骏枣3 个枣主栽品种为试材，通过液相色谱仪分析各个品种不同时期主要酸含量组分变化，明确枣主栽品种果实在不同发育时期主要酸组分含量的积累模式，并对枣果实进行RNA 提取、cDNA 反转录、qPCR 基因表达模式分析，进而作出枣主栽品种主要酸含量动态变化与相关基因的关联分析，旨在为今后枣树的分子育种和遗传改良奠定基础，并加快枣分子育种进程。

1 材料与方法

1.1 材料

以新疆主栽的3 个枣品种为试验材料，分别为以鲜食为主的冬枣、鲜食制干兼用的灰枣和骏枣，材料采摘于塔里木大学园艺试验站枣种质资源圃，该资源圃地处北纬40°32′，东经81°17′，平均海拔1 100 m，昼夜温差大，降水稀少，光照时间长，土壤为轻盐化土［10］。其树体生长结果良好，树势较为均一，无大小年现象，灌溉条件较好，管理水平较高。

于8 月初对栽培条件、管理水平及树龄大小一致的3 个主栽品种每隔10 d 进行1 次取样，3 次重复。每份样品从东南西北各个方向随机采集30 个枣果，放入冰盒带回实验室，及时将枣果果肉分离，并将其随机分成3 份用液氮速冻后放入超低温冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 酸组分含量的测定（高效液相色谱法）

1）液相色谱条件。色谱柱为Inertsil AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；二极管阵列检测器；波长210 nm；根据样品量自行调控时长；流速0.8 mL/min；流动相为0.04 mol/L KH2PO4缓冲液，用磷酸溶液将其 pH 调配至 2.6~2.8。

2）标准品制备。分别精密称取苹果酸、柠檬酸、奎宁酸标准品，用去离子水将其配制为10 mg/mL 标准溶液，分别精密吸取适量上述对照品标准溶液，加去离子水制成苹果酸、柠檬酸、奎宁酸均为1 mg/mL的混合对照品标准溶液，待测。

3）提取液制备。参照马倩倩等［11］方法，精密称取 1 g 果肉，加入 5 mL 0.04 mol/L KH2PO4（pH 2.6~2.8），研磨成匀浆，冰浴超声提取 20 min 后，转至4 ℃离心机4 000 r/min 离心10 min，取上清液，残渣重复加入磷酸缓冲液进行提取，最后定容至10 mL 容量瓶，过 0.22 μm 微孔滤膜待测。

4）含量测定。通过美国Agilent 公司生产的高效液相色谱仪1260 进行测定，根据酸组分回归方程对枣果实中酸组分进行定量。

1.2.2 枣果相关基因表达检测

1）RNA 提取。用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的B518661 柱式植物总RNA 抽提纯化试剂盒进行提取，根据说明书上的方法进行操作。

2）RNA检测。①取2 μL RNA，用NanoDrop 2000检测并记录浓度和质量，浓度最好>300 ng/μL，A260/A280值在1.8~2.1，说明RNA 质量较好，大于2.1 或小于1.8 为纯化不合格的样品，需要重新纯化。②1 倍TAE 中1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统检测，完整的未降解的RNA 电泳图谱可清晰看到18S rRNA、28S rRNA、5S rRNA 的 3 条带，且 28S rRNA 的亮度应为 18S rRNA 的 2 倍。

3）cDNA 第一条链的合成。用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的Z005163HiScriptⅢ1st Strandc DNASynthesisKit 试剂盒进行合成，根据说明书上的方法进行操作。

4）荧光定量PCR 检测。参考张春梅［7］研究结果以UBQ基因作为qPCR 内参基因，用北京全式金生物技术有限公司生产的AQ141-02 Trana Start Tip Greenq PCRSuperMix 试剂盒对枣酸代谢相关基因的相对表达量进行比较（引物序列见表1）。根据试验设计的样本数和重复点样次数将药剂加入酶标板中，用封膜密封后放入美国生产的ABIQ5 荧光定量qPCR 仪中，按以下条件进行。HoldStage：1.6 ℃/s 升温至 94 ℃保 持 30 s；PCRStage：94 ℃保持 5 s，以1.6 ℃/s 速度降至 60 ℃并保持 30 s，循环 42 次；Melt CurveStage：以 1.6 ℃/s 速度升至 95 ℃保持 15 s，以1.6 ℃/s 速度降至 60 ℃保持 1 min，以 0.075 ℃/s 上升至95 ℃保持15 s。默认条件下读取CT值，试验结果依据Livak 等［12］的方法，每个基因均以第一发育阶段的表达量为参比，计算2-ΔΔCT值进行相对表达量分析，每个发育期样品基因表达量为3 个生物学重复的平均值。

表1 qPCR 引物序列

1.3 数据统计与分析

使用Excel 2010 软件对调查数据进行统计分析并作图，DPS方差分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

将有机酸混合对照品标准溶液逐级稀释配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 等不同浓度的混合标准溶液，用0.22 μm水系微滤膜过滤，依次进样10 μL，上机测定峰面积，以有机酸浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程（表2），相关系数为0.996 95~0.999 69。

表2 酸组分测定的线性回归方程和相关系数

2.2 枣主栽品种不同时期酸组分含量变化与相关基因表达分析

2.2.1 冬枣不同时期酸组分含量变化与相关基因表达分析 由图1 可知，在冬枣果实发育过程中，3 种酸组分含量变化呈先增加后降低的趋势，其中柠檬酸在8 月13 日至9 月2 日一直占主导地位，与苹果酸、奎宁酸变化趋势一致，缓慢积累。当果实进入脆熟期（9 月12 日），3 种酸组分含量积累速度迅速增加，基本达到发育最高值，此时苹果酸积累超过柠檬酸，含量达到2.86 mg/g，之后随着果实逐渐成熟苹果酸含量迅速下降，而柠檬酸和奎宁酸含量下降幅度较小。

对冬枣果实不同发育时期的相关基因进行qP⁃CR 分析发现，在从膨大期到白熟期（8 月13 日至9月 2 日）ZjACO2、ZjMDH1和ZjMDH12基因表达量呈现先下降后上升趋势，而ZjACO1基因表达量呈逐渐下降趋势，与3 种酸组分含量变化趋势均相反。冬枣在脆熟期到完熟期（9 月12 日至10 月2 日）的发育过程中，ZjCS2、ZjMDH3和ZjMDH12基因表达量在 9月12 日达到最高，之后呈现下降趋势，其变化趋势与酸组分含量变化趋势一致，而ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表达量呈先上升后下降趋势且均在9 月22 日表达量达到最高。

2.2.2 灰枣果实不同时期酸组分含量变化与相关基因表达分析 由图2 可知，在白熟期（9 月2—12 日）灰枣果实3 个酸组分含量逐渐积累，当果实结束白熟期后，3 种酸组分含量迅速积累至脆熟期，并均在9 月12 日达到最高，其中苹果酸含量最高，达到2.985 mg/g。伴随着果实的进一步成熟（9 月12 至9月22 日），3 种酸组分含量均逐渐下降，但在完熟期（9 月22 至 10 月 2 日）柠檬酸和奎宁酸含量又小幅回升。

对灰枣果实不同发育时期的酸代谢相关基因进行qPCR 分析，发现ZjACO1和ZjCS3基因在果实膨大期（8 月13 日）表达量最低，而在果实完熟期（10 月2 日）表达量最高，而ZjCS2基因在灰枣果实发育过程中表达量呈逐渐下降趋势，与酸组分含量变化趋势相反。灰枣在脆熟期的发育过程中，所有基因表达量变化趋势同3 个酸组分含量变化趋势一致呈现迅速下降，当果实达到完熟期，ZjMDH3和ZjMDH12基因表达量依旧保持下降，与苹果酸含量变化趋势一致，而其余基因表达量均处于上升趋势，这与柠檬酸和奎宁酸含量变化趋势完全一致。

2.2.3 骏枣果实不同时期酸组分含量变化与相关基因表达分析 由图3 可知，骏枣果实在发育过程中，3 种酸组分含量均呈先上升后下降再上升的趋势。骏枣果实发育前期均以积累柠檬酸为主，在进入脆熟期前（9 月2—12 日），苹果酸迅速积累，超过柠檬酸占据主导地位。当果实进入完熟期（10 月2 日），3种酸组分含量略有回升。

对骏枣果实不同发育时期的酸代谢相关基因进行qPCR 分析，发现ZjMDH12基因在骏枣果实发育过程中呈现逐渐增加后迅速下降的表达趋势，且所有基因均在果实处于脆熟期（9 月12—22 日）表达量迅速下降，与3 种酸组分变化趋势相同。除ZjCS2基因外，其余所有基因表达量同3 种酸组分含量均在9月 12 日达到最高，且ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表达量与3 种酸组分含量变化趋势保持一致。

2.3 枣主栽品种果实酸组分含量变化与相关基因表达量的相关性分析

从表3 可知，冬枣、灰枣和骏枣果实内3 种酸组分含量均与ZjACO1和ZjCS3基因表达量呈极显著正相关，与ZjMDH1和ZjMDH3基因表达量呈正相关，与ZjCS2和ZjMDH12基因表达量表现出负相关关系；ZjACO2基因表达量与奎宁酸含量呈显著正相关，与苹果酸和柠檬酸含量表现出正相关关系。

表3 冬枣、灰枣和骏枣果实酸组分含量变化与相关基因表达量的相关性

3 讨论与结论

3.1 讨论

不同树种果实的主要有机酸种类和含量存在较大差异，在果实发育过程中有机酸含量大多呈先升高后降低的趋势［13］。试验结果表明，3 个枣主栽品种完熟期均以苹果酸含量最高，根据郑丽静等［14］对不同水果有机酸的划分，枣属于苹果酸优势型，是引起3 个枣主栽品种果实酸味的主要成分。本试验发现，3 个主栽品种酸组分含量均在白熟期进入脆熟期迅速增加 且达到最高值。这与张春梅［7］研究发现枣的酸含量在发育过程中呈积累趋势，且在白熟期或半红期达到最高的结果相一致。而Nergiz 等［15］研究发现橄榄有机酸含量随果实的发育呈上升趋势，在成熟期含量达到最高，与本研究结果有差异，这可能与品种不同等因素影响有关，尚待进一步研究认证。本试验中，冬枣果实中酸组分含量均随果实发育而增加随果实成熟而减少，而灰枣和骏枣果实中柠檬酸和奎宁酸含量伴随着果实的进一步成熟呈现增长趋势，这与马倩倩等［13］测得骏枣苹果酸质量分数在发育过程中的变化趋势呈现缓慢积累到迅速积累之后伴随果实的进一步成熟，苹果酸质量分数略微下降的变化趋势基本一致。也与李甲明等［16］测得梨果实中柠檬酸含量在整个发育过程中均呈先上升后下降的趋势基本一致。

灰枣和骏枣果实中ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表达量均在膨大期最低，在进入脆熟期表达量最高，之后迅速下降，在完熟期有所增加，整体呈现“S”曲线，其表达量趋势与各个酸组分含量变化趋势相一致，且3 个枣主栽品种果实的3 个酸组分含量与ZjACO1和ZjCS3基因表达量呈极显著正相关关系。张上隆等［17］认为早期Aco 的低活性对果实早期有机酸积累起作用。Shangguan 等［18］在对苹果、葡萄及甜橙的Aco 研究认为高的Aco 表达有助于柠檬酸和苹果酸的合成。张春梅［7］研究发现ZjCS2在枣果实成熟过程中表达较低且稳定，ZjCS3在枣果实成熟中一直呈增加趋势。因此，ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因对3 个枣主栽品种的3 个酸组分含量的积累密切相关。本研究发现冬枣、灰枣和骏枣果实中ZjCS2和ZjMDH12基因表达量与其3 个酸组分含量变化趋势有较大差异，而ZjMDH1和ZjMDH3基因表达量在脆熟期后与其3 个酸组分含量变化有相同趋势，且3个枣主栽品种果实中3 个酸组分含量与ZjCS2和ZjMDH12基因表达量呈负相关关系，与ZjMDH1和ZjMDH3基因表达量呈正相关关系，这与张春梅［7］研究判断ZjMDH1和ZjMDH3可能是影响苹果酸合成的关键基因相一致，而与其研究发现ZjMDH12促进枣苹果酸的代谢结果相反，这可能与研究材料的生长环境等因素有关，有待进一步研究。因此ZjCS2和ZjMDH12基因对3 个枣主栽品种的3 个酸组分含量的降解起到一定的调控作用，而ZjMDH1和ZjM⁃DH3基因对其酸组分含量的积累也发挥着一定的作用。

3.2 结论

3 个枣主栽品种果实发育前期均以柠檬酸积累为主，从白熟期结束进入脆熟期苹果酸开始迅速积累并占主导地位。其果实发育过程中苹果酸、柠檬酸和奎宁酸含量变化趋势基本一致，均呈现先升高后下降的趋势，但脆熟期之后冬枣的3 种酸组分含量持续下降，灰枣、骏枣酸含量在完熟期时均略有回升。3 个枣主栽品种果实成熟时苹果酸含量最高，表明苹果酸是引起其果实酸味的主要成分。枣果实发育过程中ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因与苹果酸、柠檬酸和奎宁酸的积累密切相关，而ZjCS2和ZjMDH12基因对其酸组分的降解起到一定的调控作用。