洋葱存储中腐烂病菌鉴定

惠林冲，陈微，李威亚，杨海峰，何林玉，郇国磊，王江英，缪美华，陈振泰，潘美红

(1.连云港市农业科学院 蔬菜研究室，江苏 连云港 222000；2.江苏省云台农场有限公司，江苏 连云港 222000)

洋葱(AlliumcepaL.)是重要的园艺蔬菜之一，主要用于国内市场鲜食和脱皮保鲜加工出口。国内种植户生产的洋葱采收后直接销售，均由经销商、加工企业收购和存储，种植户很少会自留存储。近几年，在市场调查发现，洋葱的存储腐烂现象越来越重，尤其是全年加工洋葱出口企业，因原料需要大量存储，经常发生同一产区、不同品种集中腐烂的问题。种植户、收购商会及时销售，而常年洋葱加工企业受损最严重。连云港海湾现代农业发展有限公司是江苏最大的洋葱加工出口企业，室外层架和低温冷库存储均会发生腐烂。对加工企业而言，腐烂的洋葱不能作为原料使用。筛选腐烂洋葱除了肉眼观察，Nishino等[1]开发了双光束光谱测量，改进了洋葱鳞茎内部腐烂的检测方法，可以在早期筛选出腐烂的洋葱，避免加工保鲜产品出口后出现腐烂现象。本研究对引起腐烂的主要病菌进行调查与鉴定，分析产生的原因，并提出相应对策，以期降低加工企业因洋葱腐烂造成的损失。

1 材料与方法

1.1 材料

洋葱品种与主要组培苗基本特征如下：连葱12号(3B)，圆形，鳞茎球颜色为白色，晚熟品种，日照类型为中日照，来自连云港市农业科学院；950，圆形，鳞茎球颜色为紫色，晚熟品种，日照类型为中日照，来自连云港市农业科学院；GSH，圆形，鳞茎球颜色为黄色，晚熟，日照类型为长日照，由连云港海湾现代农业发展有限公司提供。用于黑粉菌侵染试验组培苗3Y，扁形，鳞茎球颜色为黄色，中晚熟，日照类型为中日照，该品种为无蜡粉突变体，用鳞茎盘未经愈伤诱导直接出苗，由连云港市农业科学院提供。

1.2 方法

1.2.1 腐烂率与主要病原菌调查

洋葱采收后分别在室外常温和4 ℃低温层架存储，1个月后随机选取上、中、下不同层数各500个洋葱球，统计颈部、根部与内外部腐烂的个数，显微观察腐烂洋葱病菌类型。

1.2.2 洋葱黑霉菌分离与洋葱组培苗侵染

从洋葱外表鳞茎上取黑霉菌在MS培养基中培养，培养3 d后挑单菌落培养，然后挑取米粒大小黑霉菌的菌丝，接种洋葱组培苗3Y。以未接种黑霉菌的组培苗为对照，每批次15瓶，重复3次，记录观察组培苗的生长情况。

1.2.3 洋葱茎腐病分子鉴定

从颈部腐烂的洋葱组织中分离出腐烂组织，液氮研磨。每个样品3次重复。采用北京天根DP350-03-DNA试剂盒提取DNA。16S rDNA通用引物由苏州金唯智生物有限公司合成，上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物：AAGGA GGTGATCCAGCCGCA。PCR扩增试剂购于TAKARA公司，反应体系25 μL：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10×PCR buffer，上游引物和下游引物分别1.25 μL，2 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，0.20 μLTaq酶和15.80 mL ddH2O。PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min[2]。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶检测，胶回收纯化PCR产物，送苏州金唯智生物有限公司测序，测序结果用NCBI数据库进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 洋葱存储中腐烂率与主要特征

洋葱存储过程中，常温层架比4 ℃低温层架存储腐烂率高，可能是低温降低了微生物的繁殖。中日照品种3B和950比长日照品种GSH的腐烂率低，GSH在低温存储中腐烂率依然高达20%(表1)。从腐烂的洋葱表面观察到，3B和950从外表鳞茎干枯裂开，直接能够看到黑色的霉菌，沿着鳞茎纹路，由上端往下，由外表鳞茎向内表鳞茎感染，但大部分洋葱表面均会出现黑霉菌，不至于引起整个洋葱的腐烂(图1中A、B)。GSH外部鳞茎无破裂，看起来无腐烂现象，手摸洋葱顶部会发软，有水流出，横切面发现由顶部直接往洋葱中心腐烂(图1中C、D)。

表1 洋葱存储腐烂率与腐烂特征

A—950；B—3B；C、D—GSH。

2.2 洋葱黑霉菌侵染组培苗

将从洋葱表面分离的黑霉菌单菌落培养后，接种到洋葱组培苗(3Y)中，20 d后黑霉菌长满整个玻璃瓶，并感染洋葱组培苗，洋葱叶片上出现大量的黑霉菌孢子，而未接种的组培苗能够正常生长(图2)。

图2 黑霉菌侵染洋葱组培苗结果

2.3 洋葱茎腐病分子鉴定

洋葱颈部腐烂组织DNA经PCR扩增后获得500 bp左右的条带，测序结果显示，获得482 bp序列(图3)。DNAMAN比对结果表明，3个样品中的条带序列一致性达99%，初步认为这3个样品中的菌为同一种菌。将序列在NCBI数据库中Blast比对后，发现其与真菌葡萄球菌(Botrytisaclada)的相似度达99%以上。因此，该菌被鉴定为葡萄球菌。

图3 引起洋葱茎腐病的葡萄球菌PCR扩增序列

3 小结与讨论

洋葱在存储中引起腐烂的主要病菌为黑霉菌和葡萄球菌。对不同市场采后洋葱调查发现，黑霉菌发生率最高[3]。通常在采收后能够直观地看到黑霉菌，加工企业在收储时能够较容易辨别；而且加工企业的产品大部分是脱去最外层鳞茎，因此，黑霉菌对加工产品影响不大。通风干燥的存储条件和低温干燥都能够有效降低黑霉菌引起的腐烂率。

在加工企业存储过程中，较严重的腐烂是由葡萄球菌引起的茎腐病[4-5]。本研究中，4 ℃低温存储的长日照品种GSH的腐烂率达到了20%。该品种的茎腐病具有隐蔽性，在嫩叶中，仅表皮细胞被感染，采收之前无任何肉眼可见的症状，到洋葱球膨大后期，叶片开始倒伏干枯，葡萄球菌大量萌发，沿着洋葱茎往下感染鳞茎，葡萄球菌在快枯黄叶子上形成棕灰色菌丝体，鳞茎上出现凹陷区域和灰棕色菌丝体。一般在洋葱收获后1～2月发生腐烂[6]。

洋葱茎腐病的典型特征是从洋葱球顶部往正中心腐烂，一旦发生病变，就无法作为保鲜出口产品原料使用。通过调查连云港海湾现代农业发展有限公司发现：洋葱茎部腐烂情况近几年比较严重，与收购的品种关系不大；存储2个月，正常腐烂率在30%，有些批次洋葱甚至达到90%以上。洋葱茎腐病在田间无任何症状，种植户无需用药，采收后直接卖出，对种植户无任何影响。造成洋葱大面积茎腐病的原因与种植、采收方式有很大关系。磷肥可以提高洋葱的耐贮性，氮肥可以降低洋葱的耐贮性[7]。现在市售用于洋葱种植的水溶肥比较多，在种植后期应停止灌溉；但为追求产量，种植户在洋葱倒伏期前后仍然使用水溶肥灌溉。采收方式也会加重茎腐病的发生。一般种植户采收方式是现拔现装袋、装车，茎部伤口未愈合，加重了病菌的传播。上述因素最终导致加工企业收购洋葱后，存储过程中发生茎腐病的比例非常高。

2018年8—11月通过调查比较洋葱育种基地存储的洋葱和加工企业存储的洋葱发现，育种基地的洋葱发生洋葱茎腐病比例较低。育种基地采收的洋葱要存储越夏，秋季种植繁种用，为了降低腐烂率，在采收方式上先剪叶子后晾晒，伤口愈合后，下午或第2天才装袋[8]，同时采收前2周停止氮肥的使用和大水漫灌，所以发生病害比较轻。为了降低加工企业洋葱腐烂造成的损失，建议制定收购标准，有条件的企业发展自己原料生产基地，或与洋葱主产区种植大户或专业合作社合作，签订种植技术标准。控制室内存储湿度，降低茎腐病的发生。科研育种单位开展相关抗病品种的研发，选育高产、优质、抗病、适合加工储存的洋葱专用品种。