基于网络药理学和分子对接技术研究柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎的作用机制

李清韵谢 慧李宇思王 露

(1.成都中医药大学,成都 610072； 2.成都中医药大学附属医院,成都 610075)

鼻窦炎是由于多种因素导致的鼻腔及鼻粘膜的炎症性疾病[1]。 临床以鼻塞、流脓涕、头痛及嗅觉减退为主要症状,分为急性和慢性,前者病程短,起病急,头痛或面痛为甚,伴有发热,涕中带血等不适,后者病程长,易复发、缠绵难愈,鼻涕色白粘而量多,同时可伴有精神不振、倦怠乏力、记忆力下降等全身症状[2]。 属于中医学的“鼻渊”、“头风”、“脑漏”等范畴。 “鼻渊”最早的记载见于黄帝内经的《素问·气厥论》,曰:“胆移热于脑,则辛頞鼻渊。鼻渊者,浊涕下不止也”[3]。 鼻窦炎在各个年龄阶段均有产生,在中年及青少年较为多见,儿童也是主要群体[4-5]。 鼻窦炎在我国的患病率约为8%[6],在欧美等其他国家的发病率约为12%[7-8]。 其病因可能包括病原体感染、过敏反应,免疫功能障碍、环境因素、遗传因素等多种因素[9-12],鼻窦炎严重影响了人民的生活质量和工作效率,在国内外都引起了很大的重视与关注。

在东汉张仲景所著的《伤寒论》小柴胡汤中首次记载了柴胡黄芩药对的配伍[13],小柴胡汤为和解剂,主治伤寒少阳病证,具有和解少阳之功效。 柴胡苦凉而气轻清,性主升散,善于疏散少阳之邪,开气分之结,解表而和里；黄芩苦寒,善清气分之热,清泄少阳郁火。 二药配伍,疏散与清泄并施,则少阳之邪,内外分消,枢机因而和畅[14]。 两者配伍是和解少阳的基本结构。

中医药经过几千年的发展,积累了丰富的临床经验,形成了一个完整而独特的医学体系。 尽管由于历史原因,中医药的科学基础有待进一步巩固,但新的证据已经开始表明中医药是医学再发现的一个重要领域[15]。 中医网络药理学就是建立网络分子靶点与中医证候疾病模式之间的联系[16]。 因此,建立中药成分-靶向药物网络方法,研究中药、成分、靶点与药物之间的关系,具有十分重要的意义[17]。 本研究借助网络药理学对柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎的作用机制进行了整体研究,为其进一步药理作用研究和临床应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

通过 TCMSP 数据库(https:/ /tcmspw. com/tcmsp.php)获取柴胡-黄芩药对的成分与靶点,根据uniprot(https:/ /www.uniprot.org)数据库中的靶点信息作为统一标准,从genecard 数据库(https:/ /www.genecards.org) 获取鼻窦炎疾病靶点,运用string(https:/ /string-db.org/) 平台制作蛋白相互作用(PPI)网络；使用Metascape 平台(http:/ /metascape.org/)对靶点进行GO 富集分析,DAVID 数据库(https:/ /david.ncifcrf.gov/)对靶点进行KEGG 富集分析。 利用Cytoscape(版本号:3.8.0)软件构建网络图,从PDB(http:/ /www.rcsb.org)网站获取分子对接蛋白构象。

1.2 实验方法

1.2.1 筛选柴胡-黄芩药对的有效成分及靶点

通过中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)(http:/ /tcmspw.com/tcmsp.php)收集柴胡和黄芩的所有化学成分,选取口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18 为条件筛选活性成分,并收集活性成分的作用靶点。 并用UniProt 数据库(http:/ /www.uniprot.org/)提取相关靶点基因。

1.2.2 筛选疾病靶点

在Genecards 数据库(https:/ /www.genecards.org/)中查找,以“Sinusitis”为检索词,检索鼻窦炎相关靶点,建立疾病靶点数据集。 本研究筛选Score≥3 分的基因。

1.2.3 “药物-成分-靶点”网络构建

将柴胡-黄芩药对的靶点基因与疾病的基因取交集,利用在线工具Draw Venn Diagram 绘制韦恩图。 再将药物和疾病映射的共同靶点与药物的有效活性成分运用Cytoscape3.8.0 软件绘制“药物-成分-靶点”网络图。

1.2.4 构建PPI 及其核心网络

利用String 平台(https:/ /string-db.org/)构建PPI 网络图。 并利用Cytoscape v3.8.0 软件的在线工具Network Analyzer 进行参数设置,构建核心网络。

1.2.5 GO 富集分析与KEGG 通路分析

分别使用DAVID 和metascape 在线平台对上述获得的相关核心靶点进行GO 及KEGG 富集分析。运用在线绘图平台绘制GO 及KEGG 富集分析的气泡图、柱状图,再利用Cytoscape 软件构建“成分-靶点-通路”网络图。

1.2.6 分子对接验证

通过TCMSP 数据库获得活性成分mol2 格式化学结构,利用PDB 数据库(http:/ /www.rcsb.org/)获取相应的靶点蛋白,然后利用Auto Dock 软件进行分子对接。

2 结果

2.1 柴胡-黄芩药对的主要活性化合物及鼻窦炎作用靶点

柴胡-黄芩活性成分靶点通过TCMSP 筛选得到,柴胡化合物13 个,靶点目标348 个,黄芩化合物32 个,靶点目标507 个,筛选出相关化合物44 个(一个重合)、对应的作用靶点225 个(删除重复),应用Uniprot 数据库查询与靶点蛋白相对应的人类基因名称。 柴胡-黄芩药对的活性化合物如表1。

2.2 疾病靶点的筛选

通过Genecards 数据库筛选出鼻窦炎相关靶蛋白2510 个,筛选score≥3 的基因,共有1246 个疾病靶点,将柴胡-黄芪靶点与疾病靶点信息输入在线工具Draw Venn Diagram 进行Venn 分析,其中两组靶标重叠部分共有92 个靶标,如图1。

2.3 药物—成分—靶点网络

柴胡-黄芩药对中与鼻窦炎相关的活性成分有39 个,交集靶点有92 个,运用Cytoscape 3.8.0 绘制“药物-成分-靶点”网络图。 该图共有133 个节点,376 条边。 计算图中每个节点的连接度(degree)。其程度越高,成分或靶点在网络中发挥的作用就越关键。 排名前六的活性成分为quercetin(槲皮素)、kaempferol(山奈酚)、wogonin(汉黄芩素)、baicalein(黄芩素)、acacetin(刺槐素)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)。 如图2。

2.4 构建PPI 网络关键靶点基因

通过STRING 数据库分析92 个药物-疾病交集靶点的相互作用,设置置信度(≥0.4)并隐藏孤立靶点,共得到92 个靶点1797 条相互作用连线的PPI 网络(图3A)。 使用Network Analyzer 筛选核心靶点,通过cetiscape 2.2 插件设置连接度、介度、紧密度,通过分析筛选出柴胡-黄芩治疗鼻窦炎的关键靶点基因为TP53、AKT1、CASP3、JUN、IL6,VEGFA、MAPK1、MYC、TNF、CXCL8、EGF、PTGS2、CCND1、EGFR、MMP9 等15 个。 (图3B)

2.5 GO 富集分析

为阐明柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎靶点参与的生命过程,该研究使用metascape 在线工具对92 个靶点进行GO 富集分析,GO 富集分析由细胞组成(cellular component, CC)、 分 子 功 能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)三部分组成,以P＜0.05 为筛选条件获得BP,MF,CC富集条目分别为269,87,111 条,将排名前十的生物过程、细胞组成和分子功能利用微生信在线平台绘制成柱状图及气泡图,见图4、图5。

2.6 KEGG 富集分析

利用DAVID 在线工具对92 个靶点进行KEGG富集分析分析结果显示共富集在104 条通路上以P＜0.05 为阈值筛选排名前20 的KEGG 分析结果(Pvalue ＜0.01、基因频率＞0.05%,),其结果涉及Pathways in cancer(癌症的途径)、TNF signaling pathway(TNF 信号通路)、Apoptosis(细胞凋亡)、p53 signaling pathway (p53 信 号 通 路)、 NF-kappa B signaling pathway (NF-κB 信 号 通 路)、 PI3K-Akt signaling pathway ( PI3K-Akt 信号通路) HIF-1 signaling pathway(HIF-1 信号通路)、MAPK signaling pathway(MAPK 信号通路)Toll-like receptor signaling pathway(Toll 样受体信号通路)等通路。 根据P值选取排名Top10 的通路,利用Omicshare 在线平台绘制气泡图(图5)。

运用CytoScape3.8.0 构建成分-靶点-通路网络图, 见 图 6。 通 过 CytoScape3.8.0 内 置 的NetworkAnalyzer 分析柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎疾病网络拓扑学参数,根据拓扑学指标Degree 值大小,进行重要成分及重要作用靶点的筛选[18]。Cytoscape 网络分析表明,槲皮素连接度(degree)为61,介度(betueenness centrality)为0.2692,紧密度(closeness centrality)为0.6243,预测槲皮素为柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎的主要成分,其次为汉黄芩素、山奈酚、黄芩素、刺槐素,见表2。 PTGS2 在网络中的连接度为42,介度为0.1789,紧密度为0.5517,预测PTGS2 为柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎的主要靶点。 HSP90AA1、 PIK3CG、 PRSS1、 NOS2、 RELA、AKT1、TP53、MAPK1 亦为相对重要的靶点,见表3。a

表1 柴胡-黄芩活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of Bupleurum-Scutellaria active compound

图1 鼻窦炎疾病靶点与柴胡-黄芩靶点的韦恩图Figure 1 Venn diagram of Sinusitis disease target and Bupleurum-Scutellaria target

图2 柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎疾病的药物-成分-靶点网络Figure 2 Bupleurum-Scutellaria baicalensis’s drug for the treatment of sinusitis disease-component-target network

图3 柴胡-黄芩治疗鼻窦炎疾病的靶点PPI 网络及其关键靶点网络Figure 3 Target PPI network of Bupleurum-Scutellaria in the treatment of sinusitis and its key target network

图4 柴胡-黄芩治疗鼻窦炎疾病的靶点GO 柱状图Figure 4 Target GO histogram of Bupleurum-Scutellaria in the treatment of sinusitis

图5 柴胡-黄芩治疗鼻窦炎疾病潜在治疗靶点的富集分析Figure 5 Enrichment analysis of potential therapeutic targets of Bupleurum-Scutellaria in the treatment of sinusitis

图6 柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎疾病的成分-靶点-通路网络图Figure 6 The composition-target-pathway network diagram of Bupleurum-Scutellaria baicalensis for the treatment of sinusitis

2.7 分子对接结果

根据分析结果,结合PPI 中的关键基因和“成分-靶点-通路” 网络的主要基因为TP53,AKT1,MAPK1,PIK3CG,PTGS2,HSP90AA1 这六个核心靶点基因,与活性成分中有效靶点个数最多的成分进行分子对接,活性成分为为quercetin(槲皮素)、kaempferol(山奈酚)、wogonin(汉黄芩素)、baicalein(黄芩素)、acacetin(刺槐素)、beta-sitosterol(β-谷甾醇),结果显示这六种成分与TP53,AKT1,MAPK1,PTGS2,HSP90AA1,PIK3CG 对接能量均小于-5kcal/mol,beta-sitosterol 与PTGS2 和MAPK1 对接结果小于-10 kJ/mol, beta-sitosterol 与AKT1 和HSP90AA1 对接结果小于-9 kJ/mol,HSP90AA1 与黄芩素和刺槐素对接结果小于-8.5 kJ/mol。 分子对接结果见表4,关键靶点与活性成分的最佳复合结构见图7。

3 讨论

通过我们的研究发现,柴胡-黄芩药对的主要核心成分为槲皮素、山奈酚、汉黄芩素、黄芩素、刺槐素、β-谷甾醇这六种。 槲皮素具有抗肿瘤,抗病毒,抗炎,降低血脂等多种药理作用[19],槲皮素可通过对TLR 的负调节而抑制脂多糖诱导膜表面黏附分子和炎症因子的表达,达到抗炎作用,可降低的炎症因子为IL-1、IL-6、IL-10 等[20-21]。 山奈酚能明显的抑制炎症及其炎性细胞浸润[22]。 研究表明,山奈酚可显着抑制LPS 诱导的MDC、IP-10、IL-8 的产生[23]。 谷甾醇具有抗氧化、降低胆固醇、抗炎、免疫调节、抗肿瘤和中枢神经系统等作用[24]。 Choi等[25]人研究发现β-谷甾醇抗炎作用机制是通过减少NO 的合成,抑制巨噬细胞IL-6 活性,减少IL-1、TNF-等炎性因子的分泌。 汉黄芩素、黄芩素和刺槐素都可通过抑制相关促炎细胞因子的表达,来减轻炎症的发生[26-29]。 由图2 可知,槲皮素、山奈酚、汉黄芩素、黄芩素、刺槐素、β-谷甾醇均存在于柴胡-黄芩治疗鼻炎疾病的有效成份当中,由此提示柴胡-黄芩药效的发挥可能是多种化学成分量的积累作用的结果。

本次研究中,筛选出柴胡-黄芩治疗鼻窦炎的关键靶点基因为TP53、AKT1、MAPK1、PIK3CG、PTGS2、HSP90AA1,这些靶点蛋白都与炎症反应和免疫应答密切相关。 Tp53 通过调控许多miRNAs 的表达,诱导细胞分化、凋亡和衰老,调节细胞周期,抑制肿瘤发生等[30-31]。 AKT1 是丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)中的其中一个亚型,通过磷酸化其下游底物来促进细胞生长、代谢、凋亡等重要的细胞生物学过程[32-33]。 MAPK1 又称细胞外信号调节激酶2,是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的C 族亚族中的一个基因[34-35]。 MAPK1 途径可通过磷酸化转录因子改变基因表达,促进炎症因子产生巨噬细胞,并参与鼻窦炎的产生与发展过程[36-37]。 PTGS2 即为环氧合酶2(COX-2)的别称,有研究对COX-2 表达上调,发现与p38MAPK、NF 一KB 等信号转导通路在上皮细胞具有较强表达,表明其炎性反应机制在鼻窦炎中的作用[38-39]。且本研究还发现,多个化学成分可作用到一个靶点,如儿茶素、黄连素、汉黄芩素均可以作用到ESR1 靶点；而一个化学成分也可以作用到多个靶点,如槲皮素能够作用到TP53、C-JUN、PPARG、ST1AT1 等多个靶点。

表2 主要活性成分网络节点特征参数Table 2 Network node characteristic parameters of main active ingredients

表3 主要靶点网络节点特征参数Table 3 Characteristic parameters of main target network nodes

表4 分子对接结果Table 4 Molecular docking results

通过GO 富集分析可知,柴胡-黄芩治疗鼻窦炎的基因功能主要体现在对调节细胞代谢、对氧化应激的反应、生物调节和刺激反应循环系统过程等。KEGG 通路富集分析显示了柴胡-黄芩治疗鼻窦炎的主要信号通路。 在TNF 信号通路中,TNF-α 上调能促进粘附分子(ICAM-1、VCAM-1 等)和相关炎性因子(IL-1、IL-6、IL-12 等)在鼻窦炎中的表达[40-42]。NF-KB 信号通路可双向调控炎症和免疫相关的细胞因子表达,在与鼻窦炎有关的炎症反应中有的重要调节作用[43-45]。 国内外大量研究表明Toll 样受体通路(TLR 信号通路)可调节并影响Th1 /Th2 细胞因子的平衡[46],从而介入鼻窦炎的发病过程[47]。PI3K/AKT 信号通路有效抑制嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的活化,是治疗相关鼻窦炎疾病的一种新途径[48-49]。 MAPK 信号通路参与细胞了的增殖、分化、调亡等生理病理过程。 有研究通过抑制p38MAPK 信号通路的磷酸化可减少黏膜下炎细胞浸润,减轻鼻黏膜炎症反应,以维持鼻窦免疫机制平衡[50-51]。

分子对接分析主要用于研究分子间(如配体和受体)的相互作用,配体与受体的结合构象越稳定,则表示结合性越强,能量越低[52-54]。 本研究以原配体作为分数对象,显示化学成分与靶点对接分数都接近或小于原配体得分。 通过关键靶点与活性成分的最佳复合结构发现,β-谷甾醇和PTGS2、β-谷甾醇和MAPK1、β-谷甾醇和HSP90AA1、β-谷甾醇和AKT1、刺槐素和HSP90AA1、黄芩素和HSP90AA1均有较好的结合,因此提示柴胡-黄芩药对的关键化学成分与关键蛋白具有较好的结合活性,也进一步佐证了基于网络药理学辨识有效成分的可靠性。

图7 关键靶点与活性成分的最佳复合结构Figure 7 The optimal composite structure of key targets and active

本研究利用网络药理学和分子对接技术初步分析了柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎的作用机制。 但研究仍存在一些不足之处:①本研究所用数据库的准确性与可靠性仍有待进一步考证,不同的数据库获得的数据与研究结果可能存在一定差异,后期还需开展多数据的研究。 ②本研究所构建生物网络数据均为定性数据,而中药复方内部成分复杂,相互作用关系复杂,相对于定量数据而言,本研究结论的准确性尚有待进一步提高。 ③本研究尚未涉及柴胡-黄芩药对的剂量、煎煮方法、服用方法等对鼻炎疾病治疗的实际效果,且目前临床上也未有柴胡-黄芩药对的动物实验与人体实验,后期还应该结合体内外实验进一步验证柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎疾病的分子机制。

总而言之,中药具有多组分、多靶点、多通路、协同作用的特点,本文利用网络药理学对柴胡-黄芩构建网络模型,识别潜在和活性成分,构建药物靶点网络和靶病网络,分析其中药理论研究和药理作用。 本文的研究数据有一定的预测性和客观性,可通过设计柴胡-黄芩药对治疗鼻窦炎的动物实验研究进一步证实其作用机制。