保存条件对恒河猴CD8+ T 细胞活性的影响

罗嘉慧卢秋翰李国萃张京京丛 喆魏 强

(北京协和医学院比较医学中心,中国医学科学院医学实验动物研究所,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室,北京 100021)

CD8+T 细胞在多种病毒感染性疾病的免疫控制中起着至关重要的作用,一般认为对病毒复制有更好控制能力的患者拥有更强的特异性T 细胞应答,其CD8+T 细胞也具有更高的细胞因子生产能力[1-4],但仍需要更多的相关研究来支持。 CD8+T细胞活性测定对细胞功能评定直接相关。 由于实验条件限定,通常情况下细胞及组织常冷冻(-80℃、液氮等)保存[5-6],冻存会对细胞的部分理化状态造成影响[7],但在多大程度上影响细胞活性,缺乏实验依据。 因此,通过实际样本测定,了解冻存对其活性的影响,有重要的实际应用意义,也为今后的细胞内细胞因子染色实验提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 实验动物

9 只SPF 级中国恒河猴,4 只雌性,5 只雄性,年龄为3～6 岁,体重约4 ～5 kg,均购自北京协尔鑫生物资源研究所[SCXK(京)2015-0011]。 实验前通过免疫荧光法筛查,排除猴疱疹病毒,猴逆转录D型病毒,猴免疫缺陷病毒及猴T 淋巴细胞性I 型病毒。 实验动物的饲养及实验操作在中国医学科学院医学实验动物研究所生物安全三级实验室进行[SYXK(京)2017-0027],实验进程遵循3R 原则。本实验使用的实验动物程序通过了中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会(IACUC)的批准(XJ19006)。

1.2 主要试剂与仪器

Cell Stimulation Cocktail(500×)(Cat.00-4975)购自eBioscience 公司；BD HorizonTMBV605 Mouse Anti-Human CD3(Cat. 562994)、BD PharmingenTMFITC Mouse Anti-Human CD8 (Cat. 557085)、 BD HorizonTMBV421 Mouse Anti-Human MIP-1β(Cat.562900)、BD HorizonTMPE-CF594 Mouse Anti-Human CD107a(Cat. 562628)、BD Cytofix/CytopermTMBD Cytofix/Cytoperm Plus Kit(with BD GolgiStop)(Cat.554715)购自BD Pharmingen 公司；Brilliant Violet 421TManti-human IL-2 Antibody(Cat. 500328)、PE anti-human TNF-α Antibody(Cat. 502909)、Zombie NIRTMFixable Viability Kit(Cat.423106)、Brefeldin A(Cat. 420601)、 Brilliant Violet 510TManti-human IFN-γ Antibody(Cat. 502544)购自BioLegend 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样本采集和外周血单个核细胞制备

使用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)采血管采集猴抗凝全血,使用Ficoll 淋巴细胞分离液分离外周血单核淋巴细胞,一部分新鲜细胞直接用于检测。 一部分使用加入了10% DMSO 的胎牛血清作为冻存液冻存于-80℃和液氮中。

1.3.2 细胞内细胞因子染色

淋巴细胞悬液加入48 孔板中,每孔1 mL,设阳性刺激组和阴性对照组。 阳性刺激组加入1×阳性刺激物,阴性对照组只加培养基。 1 h 后加入布雷菲德菌素A(Brefeldin A),GolgiStop 和CD107a 抗体,于37℃5% CO2培养箱中继续培养5 h,收细胞进行流式数据分析[8-12]。

收取细胞,使用细胞死活染料(Zombie NIRTMFixable Viability Kit)将细胞在室温下染色20 min。然后洗涤细胞并在4℃下用表面染色混合物染色30min。 随后将PBMC 洗涤2 次,然后用固定/透化溶液Fixation/Permeabilization solution 在4℃下固定并透化20 min。 随后将细胞在用1 ∶10 稀释的Perm/WashTMBuffer 中洗涤两次。 然后在4℃下用胞内染色混合物染色30 min。 洗涤后将细胞重悬于1%多聚甲醛中,并在4℃下在黑暗中储存不超过24 h 直至分析。

1.4 统计学方法

数据由BD ArialⅡ流式细胞仪收集,从每个样品收集30000 个淋巴细胞。 采用FlowJo 10 对多色流式细胞仪上机结果进行分析,使用Graphpad 8 软件进行作图和统计分析,不同组数据间进行t检验分析,以P＜0.05 为具有统计学差异界限。

2 结果

2.1 不同保存条件下细胞存活率

保存条件对细胞状态影响较大。 新鲜分离的PBMC 中活细胞占(95.19±3.37)%,而经液氮冻存1 周后,活细胞比例为(84.23±4.35)%,冻存1 年后,活细胞占(54.43±6.79)%,显著低于经液氮冻存1 周后的细胞(P＜0.0001)。 -80℃冻存1 周后活细胞比例为(75.46±4.50)%,冻存1 年后活细胞只占(40.63±5.26)%,显著低于-80℃冻存1 周后的细胞(P＜0.0001)(图1)。

2.2 阳性刺激物刺激淋巴细胞分泌细胞因子流式结果

以CD8+T 淋巴细胞群做为目的细胞,以同型对照为基准划十字门。 使用PMA 和离子霉素Inomycin 做为阳性刺激物刺激培养新鲜细胞6 h后,细 胞 高 表 达MIP-1β、 IL-2、 IFN-γ、 TNF-α 和CD107a。 见图2。

注:与新鲜细胞比较,****P＜0.0001；与细胞液氮冻存一周比较,***P＜0.001,****P＜0.0001；与细胞-80℃冻存一周比较,***P＜0.001,****P＜0.0001；与细胞液氮冻存一年比较,***P＜0.001。图1 不同保存条件下PBMC 的存活率Note. Comparing to fresh cells, ****P＜0.0001. Comparing to cell frozen for a week in liquid nitrogen, ***P＜0.001,****P＜0.0001. Comparing to cell frozen for a week in -80℃, ***P＜0.001,****P＜0.0001. Comparing to cell frozen for a year in liquid nitrogen, ***P＜0.001.Figure 1 Survival rate of PBMC under different storage conditions

图2 流式分析CD8+ T 淋巴细胞胞内细胞因子表达情况Figure 2 Flow cytometric analysis of intracellular cytokine expression in CD8+ T lymphocytes

2.3 不同保存条件下胞内细胞因子及细胞脱粒标志物表达结果

PMA 和离子霉素Inomycin 做为阳性刺激物培养PBMC 6 h 后,不同保存条件下胞内细胞因子及细胞脱粒标志物表达量如表1 所示,在MIP-1β 的表达中,新鲜细胞与冻存一周的细胞没有显著差异,但液氮冻存超过一年的细胞的表达量显著高于新鲜细胞(P＜0.001),液氮冻存一周的细胞与80℃冻存一周的细胞没有显著差异,液氮冻存超过一年的细胞与80℃冻存超过一年的细胞没有显著差异。在IL-2 的表达中,各组别均无显著差异。 在IFN-γ的表达中,新鲜细胞的表达量显著高于液氮冻存一周的细胞(P＜0.0001),新鲜细胞与液氮冻存超过一年的细胞没有显著差异,液氮冻存一周的细胞与80℃冻存一周的细胞没有显著差异,液氮冻存超过一年的细胞与80℃冻存超过一年的细胞没有显著差异。 在TNF-α 的表达中,新鲜细胞与冻存一周的细胞没有显著差异,但液氮冻存超过一年的细胞的表达量显著高于新鲜细胞(P＜0.0001),液氮冻存一周的细胞与80℃冻存一周的细胞没有显著差异,液氮冻存超过一年的细胞与80℃冻存超过一年的细胞没有显著差异。 在CD107a 的表达中,各组别均无显著差异。 (图3)

表1 不同保存条件下胞内细胞因子及细胞脱粒标志物表达量Table 1 Expression of intracellular cytokines and cell degranulation markers under different storage conditions

图3 不同保存条件下胞内细胞因子及细胞脱粒标志物表达情况分析Figure 3 Analysis of the expression of intracellular cytokines and cell degranulation markers under different storage conditions

3 讨论

近年来,越来越多的研究支持血液CD8+T 细胞反应与多种病毒感染性疾病控制有着密切的关系,CD8+T 细胞主要通过分泌细胞毒性颗粒和细胞因子来发挥其效应功能,因此同时选取CD8+T 细胞的细胞脱粒标志物及4 种细胞因子(CD107a,IFN-γ,MIP-1β,TNF-α 和IL-2)的分泌量来评估CD8+T 细胞反应的水平,是现在较多采用的一种方法[2-13]。现今部分测量CD8+T 细胞反应水平的实验使用新鲜的细胞[14-15],但是由于实验安排的不同,大部分测量CD8+T 细胞反应水平的实验都需要用到冻存细胞[11],但是,在不同条件下,冻存会多大程度上影响细胞活性,缺乏确切的实验依据,实验样本的冻存条件对实验结果的影响尚未得到评估。

本实验在保证冻存液的成分,血细胞的分离条件、细胞复苏的过程等变量条件一致的情况下,探究冻存条件对恒河猴CD8+T 细胞活性的影响。 结果发现不同冻存条件对细胞存活率影响较大,细胞存活率因冻存而衰减,冻存时间越长,冻存温度越高,细胞死亡率越高。 不同冻存条件的细胞因子及细胞脱粒标志物的表达量也不同,总体来说,短时间冻存的细胞反应水平与新鲜细胞最为接近,而长时间冻存的细胞,在MIP-1β 和TNF-α 的表达量上与新鲜细胞有显著的差异。 由于本实验采集自恒河猴实验样本,数量受限,未做样本差异分析,条件充许时,尽量采集足量样本,并排除因样本差异造成可能的影响。 因此为了保持正常的CD8+T 细胞反应和高的细胞存活率,应使用新鲜细胞或短期冻存的细胞进行测量CD8+T 细胞反应水平的实验,而在测定长期保存标本中,也应充分了解活性因冻存而有所变化。