化痰祛瘀方在肝豆状核变性模型小鼠海马神经细胞增殖中的作用及相关机制研究

房如意，谢道俊

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

细胞信号通路在机体内的作用显著，正常细胞的增殖、分化等进程均受细胞信号通路的调控[1-2]。然而，信号转导通路的异常可能诱发机体发生一系列变化。PI3K-AKT-mTOR信号通路已被证实与人类疾病的发展关系密切[3]，PI3K、AKT和mTOR是该通路的关键信号靶点，与组织细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等能力密切相关[4-6]。Wilson病又称威尔逊病，是先天性铜代谢障碍性疾病[7]。

近年来，中药方和天然动植物提取物已被证实在抵抗细胞增殖、凋亡、抑制促癌基因表达、诱导抑癌基因表达等方面发挥重要作用[8-9]；同时，其具备易获得、效果优良等优点，在延长患者生存期和减少复发转移上作用显著[10]。本研究基于前人研究成果[11]，进一步探讨化痰祛瘀方在Wilson病模型小鼠海马神经细胞增殖中的作用及PI3K-AKT-mTOR信号通路相关机制。

1 资料与方法

1.1 实验试剂、仪器及药物 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和DMEM培养基(Hyclone公司，中国)；RIPA裂解液(Beyotime，中国)；二甲基亚砜(Beyotime，中国)；聚偏氟乙烯膜和脱脂奶粉(PVDF；Millpore，USA)；甲醇(富宇精细化工，中国)；电泳试剂盒(Sigma，USA)；Western blot一抗和二抗(Boster，中国)；微量移液枪(Eppendorf，Research®plus)；细胞培养板(Corning，USA)；二氧化碳恒温饱和湿度培养箱(Sanyo，日本)；SDS-PAGE试剂盒(Sangon，USA)；化痰祛瘀方配方溶液由本院制备。

1.2 Wilson病小鼠模型分组和药物处理

1.2.1 实验小鼠分组：购买20只健康4月龄Wilson病模型TX小鼠，平均体重为(22±2)g，将其饲养于室温18～26 ℃、相对湿度50%～60%、模拟自然照明周期12/12 h的独立通气笼具。给予TX小鼠标准饲料，自由摄取食物和水。同时购买10只健康4月龄DL小鼠，平均体重为(22±2)g，雌雄对半，作为正常对照，同上法饲养。

1.2.2 实验小鼠药物处理：中药化痰祛瘀方组方为，泽泻、金钱草各24 g,大黄、姜黄、黄连各20 g,三七3 g。将姜黄、黄连、泽泻、金钱草和三七以蒸馏水浸泡0.5 h后，高火煎煮，后加大黄，文火煎煮。过滤网过滤，重复添加蒸馏水，再次煎煮和过滤，浓缩至生药量2.2 g/ml，药液密封储存于4 ℃冷藏箱。

模型组TX小鼠(n=10)饲养环境和饲养方法同上所述。选用纯净饮用水，2次/d，每次0.2 ml/10 g体重的剂量灌胃。而实验组小鼠(n=10)则按上述制备中药汤剂按0.2 ml/10 g体重的剂量灌胃(2次/d)。两组前述处理时间为期28 d。另设正常对照组，将DL小鼠以前述同样饲养方法置于相同环境，按照模型组TX小鼠灌胃方式进行处理。

1.3 实验方法

1.3.1 脑组织取材：末次给药12 h每组各取5只小鼠处死取材。以10%水合氯醛深度麻醉小鼠，断头脱颈处死。快速取实验小鼠全脑，预冷PBS冲洗脑组织表面血液，快速获取海马区组织，低温冻存于液氮中，一部分用于HE染色，一部分用于Western blot检测。

1.3.2 Western blot检测PI3K-AKT-mTOR信号通路相关因子蛋白表达水平：采用 Western blot 检测PI3K-AKT-mTOR信号通路相关因子p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR及PCNA、Ki-67等细胞增殖相关蛋白的表达。取适量组织，加裂解液，快速研磨组织，冰上充分裂解。离心取上清液，部分上清液用于BCA法测定蛋白含量；其余蛋白样品变性冻存后，上样，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，将PVDF膜置于孵育盒，加入适量稀释后一抗(兔抗人p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR及PCNA、Ki-67单克隆抗体)，于4 ℃下孵育过夜；后经HPR标记二抗室温下孵育1.5 h后，进行ECL显色。选取β-actin为内参，图像分析使用Image J软件。

1.3.3 Brd U掺入法检测化痰祛瘀方处理Wilson病模型小鼠海马神经细胞增殖：采用Brd U掺入法检测化痰祛瘀方处理Wilson病模型小鼠海马神经细胞增殖。每组剩余5只小鼠备用。将Brd U溶液以生理盐水稀释制备成待用实验溶液(5 mg/ml)。配制后按50 mg/kg进行腹腔注射，每4 h注射1次，共计3次。末次注射后间隔4 h处死实验小鼠取材。石蜡包埋制备组织切片，行免疫荧光染色。观察小鼠海马齿状回神经细胞增殖情况。于200倍荧光显微镜下选取5个视野，计数Brd U阳性细胞，计算细胞增殖率。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，两组间样本均数比较采用t检验。计量资料用均数±标准差表示，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色观察三组海马组织病理学变化 检测结果显示对照组海马区神经细胞排列紧密，核圆而大，神经纤维排列整齐而密集；模型组神经细胞排列稀疏，核小深染，胶质细胞增生；同时，实验组神经细胞排列排列较模型组整齐，核固缩减轻，胶质细胞轻度增生(图1)。

2.2 Western blot检测PI3K-AKT-mTOR信号通路相关因子蛋白相对表达水平比较 见表1。检测结果显示，与正常对照组比较，模型组总PI3K、AKT和mTOR蛋白水平以及p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平明显升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)；提示PI3K-AKT-mTOR信号通路的激活。同时，与模型组相比，实验组总PI3K、AKT和mTOR蛋白水平以及p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平则明显抑制(均P<0.05)；提示PI3K-AKT-mTOR信号通路的抑制。且与正常对照组比较，实验组总PI3K、AKT和mTOR、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

图1 三组海马组织病理学表现(HE染色，×400)

表1 三组PI3K-AKT-mTOR信号通路相关因子蛋白相对表达水平比较

2.3 Western blot检测增殖相关因子蛋白相对表达水平比较 见表2。与正常对照组比较，模型组PCNA和Ki-67蛋白相对表达水平明显降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。同时，与模型组比较，实验组PCNA和Ki-67蛋白相对表达则明显升高(均P<0.05)。与正常对照组比较，实验组PCNA和Ki-67蛋白相对表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 三组增殖相关因子蛋白相对表达水平比较

2.4 Brd U掺入法检测化痰祛瘀方处理Wilson病模型小鼠海马神经细胞增殖 Brd U掺入法检测化痰祛瘀方处理Wilson病模型小鼠海马神经细胞增殖情况。模型组Brd U阳性细胞数(10.65±3.24)较正常对照组(60.22±9.37)明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时，与模型组相比，实验组Brd U阳性细胞数(144.68±14.60)则显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比，实验组Brd U阳性细胞数亦明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

Wilson病得名于1911年Wilson的首次报道，又称肝豆状核变性，或威尔逊变性[7]。该病好发于青少年，是一种常染色体隐性遗传性疾病，主要表现为先天性铜代谢障碍[12]。Wilson病的临床表现包括食欲不振、轻度黄疸、肝脏肿大和腹水，部分患者可能出现进行性脾脏肿大和脾功能亢进等[13]。Wilson病的治疗受益于早期诊断，以纠正患者铜代谢平衡。肝、脑、肾、角膜等脏器的铜沉积可进一步导致患者组织损害及病变，因此及早诊疗对于Wilson病患者至关重要。在中医学角度而言，考虑到Wilson病的病机，铜在维持人体正常新陈代谢上发挥重要作用。然而，病理条件下，机体水液代谢失常，导致血淤痰堵，进而痰淤互结，最终构成Wilson病的主要病机[14-15]。基于前述内容，痰淤互结构成Wilson病治疗的关键。

在本研究中，针对Wilson病痰淤互结的病因以及铜代谢障碍的病理，笔者研究团队选用Wilson病模型4月龄TX小鼠设置治疗方案实验组和模型对照，并选用4月龄DL小鼠作为模型对照，探究本研究组方对Wilson病模型小鼠海马神经细胞增殖的影响，明确该组方的效果。本研究所选化痰祛瘀方以大黄、姜黄、黄连、泽泻、金钱草和三七六味药为主，其中，大黄和黄连可有助于促进机体铜排泄，发挥解毒功效[16-17]；姜黄和三七可活血化瘀[18-19]，泽泻可利水渗湿、泄热泄浊，金钱草可解毒散瘀[20-21]。

成年鼠的神经干细胞一般处于相对静息状态，而脑损伤或缺血等病理状态可引起海马神经再生[22]。同时，Brd U是胸腺嘧啶的衍生物，其掺入具有稳定性，可随DNA复制进入细胞[23]。因此，Brd U特异性抗体的使用可检测Brd U掺入情况，从而反映细胞增殖能力。本研究发现与正常小鼠相比，模型小组Brd U阳性细胞数降低，提示铜代谢障碍导致海马神经细胞增殖的抑制；而实验组Brd U阳性细胞数升高，提示化痰祛瘀方可有助于促进海马神经细胞增殖。模型组PCNA和Ki-67蛋白表达水平与正常对照组相比明显降低；而与模型组相比，实验组PCNA和Ki-67蛋白表达则明显升高。PCNA和Ki-67为常见细胞增殖相关标志物，二者水平变化与细胞增殖呈正相关[24]。此外，与正常对照组相比，模型组总PI3K、AKT和mTOR以及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白水平较正常对照组明显升高；而实验组前述指标水平则较模型组显著降低。众所周知，PI3K、AKT和mTOR为PI3K-AKT-mTOR信号通路关键蛋白，其中PI3K可通过磷酸化产生磷脂酰基磷酸酶酯；AKT是PI3K下游关键蛋白；而mTOR是保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是该通路的关键位点；三者可参与细胞生长、增殖和凋亡等[25]。以上结果提示化痰祛瘀方对Wilson病具有明显的抑制作用。因此，我们初步认为化痰祛瘀方是通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路激活从而发挥抑制Wilson病模型小鼠海马神经细胞增殖作用的。

综上所述，本研究通过Wilson病模型TX小鼠实验证实，化痰祛瘀方处理可有助于促进Wilson病小鼠海马神经细胞增殖，上调PCNA和Ki-67蛋白表达水平。其机制可能与抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路激活，下调PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平相关。