穿山龙多糖的提取及其体外抗氧化活性研究

朱梦尧，旁赟宁，谭景全，吕 冲，陈祥娥

（济宁医学院 生物科学学院，山东 日照 276826）

穿山龙，薯蓣科，又名黄姜，大部分分布于海拔较高的地方，生长温度以15～25 ℃最佳[1]。穿山龙具有活血舒筋、止咳平喘、消食利水、止痛等功效；民间多用于浸酒或煎服，可用于慢性支气管炎、筋骨疼痛、风湿性关节炎等症的治疗。现代药理研究表明，穿山龙具有调节免疫、改善心血管、祛痰、抗肿瘤、抗炎镇痛等多种药理作用，应用前景十分广阔[2-7]。目前对穿山龙药用成分的研究以皂苷为主，对多糖研究较少[8-10]。中药多糖类成分具有显著的降血糖、抗氧化、调节机体免疫功能等作用，是当前研究热点之一[11-14]。为加强穿山龙药材的综合应用，本试验采用水提醇沉法提取穿山龙多糖，考察料液比、水浴温度和提取时间的影响，并进行正交试验优化。对所得穿山龙多糖的体外抗氧化活性进行考察，为穿山龙多糖的标准化提取和药材的综合开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

752N紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；TDL-60B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-1数显电子恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；BS110型电子天平（德国赛多利斯）；X3R离心机（美国赛默飞世尔）；DHG-9030A干燥器（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 样品与试剂

穿山龙药材由中药学教研室提供并鉴定；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma），葡萄糖对照品，无水乙醇，抗坏血酸（Vc），浓硫酸，苯酚，氢氧化钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，邻苯三酚，三氯化铁，铁氰化钾等均为分析纯。

2 方法

2.1 穿山龙多糖提取工艺

取干燥的穿山龙根茎，粉碎过80目筛。取一定量的药粉按相应的提取条件浸渍提取2次，合并提取液，浓缩后醇沉，所得沉淀复溶后经进一步纯化干燥获得干浸膏。分别研究料液比、水浴温度及提取时间等因素水平变化对所得多糖的影响，以此为依据进行正交试验优化。

2.2 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。取葡萄糖对照品10 mg，溶解后加蒸馏水定容于100 ml量瓶中，得葡萄糖对照品溶液。选取8只试管，分别加入0.1～0.8 ml葡萄糖对照品溶液，加水稀释到1.0 ml。分别加入6 %苯酚溶液0.5 ml及浓硫酸2.5 ml，混匀后静置20 min。另取一只试管作为对照，加入蒸馏水1.0 ml和上述相应体积的苯酚、浓硫酸，490 nm处测定吸光度（A490）值，以A490为纵坐标（y），以葡萄糖浓度为横坐标（x，μg/ml），绘制标准曲线。

2.3 穿山龙多糖提取的单因素实验

2.3.1 料液比的影响 分别称取20 g穿山龙药粉，固定提取温度为90 ℃，提取时间为3 h，考察料液比分别为1:6，1:10，1:14，1:18条件下，所得穿山龙多糖的含量。

2.3.2 水浴温度的影响 分别称取20 g穿山龙药粉，固定料液比为1:10，提取时间为3 h，考察提取温度分别为60，70，80，90 ℃条件下，所得穿山龙多糖的含量。

2.3.3 提取时间的影响 分别称取20 g穿山龙药粉，固定料液比为1:10，提取温度为90 ℃，考察提取时间分别为2，3，4，5 h条件下，所得穿山龙多糖的含量。

2.4 正交试验设计

在单因素实验基础上进行正交试验，对料液比、水浴温度、提取时间进行三因素两水平的实验并分析，正交试验设计参数及水平见表1。

表1 正交试验参数及水平

2.5 穿山龙多糖体外抗氧化性研究[15]

其中，ΔAx为样品的自氧化速率；ΔA0为邻苯三酚自氧化速率。

2.5.2 总还原能力实验 将所得穿山龙多糖加水配制成浓度分别为0.1，0.5，1，2，5，10，15 mg/ml的样品溶液。分别取0.2 mol/L的磷酸缓冲液（pH 6.6）和1 %铁氰化钾溶液各2.5 ml，混匀后分别加入不同浓度的样品溶液各1 ml，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷却，并依次加入蒸馏水2.0 ml，0.1 % FeCl32.0 ml，混匀，室温静置10 min后，测定700 nm处吸光度（A700），以Vc为阳性对照[9]，每组平行测定3次。

2.5.3 DPPH•清除能力实验 将所得穿山龙多糖加水配制成浓度分别为0.1，0.5，1，2，5，10，15 mg/ml的样品溶液。取5 ml样品溶液，置于试管中，分别加入0.2 mmol/L DPPH•乙醇溶液1 ml，混匀，室温下避光放置30 min，以乙醇溶液为空白对照，测定517 nm处吸光度（A517），Vc为阳性对照，每组平行测定3次。

DPPH•自由基清除率（%）=[1-（Ax-Ac）/A0]×100 %

其中：Ax为样品吸光度；A0为空白组吸光度；Ac为样品本底吸光度。

2.6 数据处理

3 结果

3.1 葡萄糖标准曲线

按2.2项所述硫酸-苯酚法，得葡萄糖测定标准曲线回归方程为y=0.012x-0.007，R2=0.992。由标准曲线可知葡萄糖浓度与A490之间线性关系良好，可用于多糖含量的测定。

3.2 单因素实验结果

3.2.1 料液比对穿山龙多糖提取率的影响 料液比对穿山龙多糖提取率的影响见图1。由图1可见，随着料液比的增加，多糖提取率呈上升趋势，当料液比高于1:10后，提取率增加不明显，估计此时组织中多糖溶出已近饱和，为节约成本，确定适宜料液比为1:10。

图1 料液比对穿山龙多糖提取率的影响

3.2.2 水浴温度对穿山龙多糖提取率的影响 水浴温度对穿山龙多糖提取率的影响见图2。由图2可见，随着温度的增加，多糖提取率明显上升，当温度达到90 ℃左右，提取率仍有增加趋势，变动不大，因此将提取适宜温度选定为90 ℃。

图2 水浴温度对穿山龙多糖提取率的影响

3.2.3 提取时间对穿山龙多糖提取率的影响 提取时间对穿山龙多糖提取率的影响见图3。由图3可见，随着时间的延长，多糖提取率基本呈上升趋势，考虑提取效率和效果，提取时间以4 h左右为好。

图3 提取时间对穿山龙多糖提取率的影响

3.3 正交试验

根据单因素实验结果，进行三因素两水平的正交试验优化，结果见表2。由表2可见，对穿山龙多糖提取率影响最大的因素为提取时间，其次是水浴温度，影响较小的是料液比。综合以上分析结果，并考虑实际生产过程中的需要，确定最佳提取工艺为：料液比1:10，水浴温度90 ℃，提取时间4 h。此条件下所得粗多糖提取率为2.72 %。

表2 正交试验结果

3.4 穿山龙多糖的抗氧化活性

图4 穿山龙多糖（A）与Vc（B）的清除能力

3.4.2 总还原能力测定 总还原能力试验中，抗氧化剂可作为电子供体将铁氰化钾的Fe3+还原成Fe2+，形成亚铁氰化钾，后者进一步与FeCl3反应，生成在700 nm下有强吸收的普鲁士蓝，抗氧化剂的还原能力越强，A700越高。穿山龙多糖总还原能力结果见图5，结果表明随着多糖浓度逐渐升高，A700上升，当浓度大于3 mg/ml后，吸光度趋于平稳（约0.249±0.001）。实验测得Vc浓度在0.1～0.5 mmol/L范围内与A700线性关系良好，所得穿山龙多糖的总还原力最大值约相当于（0.338±0.006）mmol/L Vc的还原力。

图5 穿山龙多糖（A）与Vc（B）总还原能力

3.4.3 DPPH•清除能力 DPPH•为一种性质较为稳定的自由基，抗氧化性物质能提供电子，灭活DPPH•同时削弱其A517。穿山龙多糖DPPH•清除能力见图6，随着多糖浓缩的升高DPPH•清除率逐渐上升。当浓度大于5 mg/ml时，清除率趋于平稳，最大值为85.63 %±0.43 %（15 mg/ml）。在0.12～0.60 mmol/L范围内Vc的DPPH•清除率与浓度呈线性关系，所得穿山龙多糖的DPPH•清除能力最大值约相当于（0.520±0.015）mmol/L Vc的清除能力。

图6 穿山龙多糖（A）与Vc（B）对DPPH•清除能力

4 小结与讨论

穿山龙具有免疫调节、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗突变等作用[16]。本实验考察了穿山龙多糖水醇法提取工艺的关键因素，并进行了正交试验优化，确定关键因素中，对多糖提取率影响最大的是提取时间，其次为水浴温度，而料液比的影响较小。确定最佳工艺为料液比1:10，水浴温度90 ℃，提取时间4 h，多糖提取率为2.72 %。所得多糖经进一步纯化后进行了体外抗氧化性研究，实验发现穿山龙多糖对及DPPH•均表现出良好的清除能力，对Fe3+也具有较好的还原力，具有开发为抗氧化剂的潜能，其抗氧化作用具有一定的剂量依赖性。本实验为穿山龙多糖的标准化提取和药材的综合开发利用提供了一定的研究基础和参考。