高效离子色谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中单糖及功能性低聚糖的研究

（辽宁省食品检验检测院（辽宁省盐品质量监督检验中心），辽宁 沈阳 110015）

糖是人体所需能量最主要的来源，也是婴幼儿生长发育的必需品之一。婴幼儿配方奶粉是参照母乳的组成成分，以乳类和乳蛋白制品为原料配制而成的，含有丰富的营养成分，单糖和功能性低聚糖也是其重要组成成分。目前糖类物质的分析主要有3类方法：化学法、色谱法和酶学法[1-9]。离子色谱法结合金电极脉冲安培检测是目前糖类物质分离和定量分析的理想方法，该方法灵敏度高，稳定性好，样品无需复杂的样品前处理，操作简便迅速，能同时测定多种离子。为此，本研究建立对葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖4种单糖和棉子糖、水苏糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、蔗果八糖、蔗果九糖9种功能性低聚糖的同时检测离子色谱法，并对市售样品进行测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ICS-5000离子色谱仪（美国戴安），配备脉冲安培检测器，金工作电极和银/氯化银参比电极；CarboPacTMPA20型分析柱（3 mm×150 mm，美国戴安）；CarboPacTMPA20保护柱（3 mm×50 mm，美国戴安）； X1R高速冷冻离心机（美国热电公司）；Milli-Q A10纯水机（美国Millipore公司）.

1.2 材料

葡萄糖对照品（中国计量研究院，含量99.6 %）；果糖对照品（中国计量研究院，含量99.7 %）；蔗糖对照品（中国计量研究院，含量99.7 %）；棉子糖对照品（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%）；水苏糖对照品（Sigma，含量98.0 %）；麦芽糖对照品（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.5 %）；蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖，蔗果六糖，蔗果七糖，蔗果八糖，蔗果九糖对照品（成都瑞芬斯生物科技有限公司，纯度＞98 %）；NaOH（美国赛默飞，色谱级）；乙酸钠（美国赛默飞，色谱级)；试验用水为一级水；婴幼儿配方奶粉（市售）。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

分别精密称取葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、水苏糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、蔗果八糖和蔗果九糖对照品适量, 用超纯水稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为1.0 mg/ml的混合对照品储备液，4 ℃保存。将上述储备液用超纯水稀释为10 mg/L的混合对照品中间液。用时临用现配。

2.2 淋洗液的配制

流动相B：取50 %氢氧化钠溶液6.5 ml，用水稀释定容至500 ml，在氮气保护下摇匀，配制成250 mmol/L氢氧化钠淋洗溶液。

流动相C：称取20.5 g无水乙酸钠，用水溶解并定容至500 ml，在氮气保护下摇匀，配制成500 mmol/L乙酸钠淋洗溶液。

2.3 样品处理

取试样0.5 g，精密称定，置入20 ml量瓶，加入16 ml 60 ℃温水溶解，涡旋2 min，超声20 min，加入3 %乙酸溶液0.4 ml，取出，放置至室温，加水定容至刻度，摇匀，于4 ℃、8000 r/min离心3 min。取上清0.2 ml，加水稀释至10 ml，摇匀，过0.22 μm滤膜和RP柱，续滤液供色谱分析备用。

2.4 色谱条件

色谱柱：CarboPacTMPA20（3 mm×150 mm）分析柱，CarboPacTMPA20（3 mm×50 mm）保护柱；柱温：30 ℃；梯度洗脱，程序见表1。检测方式：脉冲安培法检测，金电极，银/氯化银参比电极；糖标准四电位波形见表2。进样量：25 μl。

表1 淋洗液洗脱程序

表2 糖标准四电位波形

3 结果与分析

3.1 离子色谱淋洗液选择

采用离子色谱分析糖类物质，单糖测定通过调节不同浓度氢氧化钠淋洗液达到较好分离效果。功能性低聚糖测定采用氢氧化钠和乙酸钠溶液进行梯度洗脱，乙酸钠可增强洗脱效果，改善功能性低聚糖的分离度，缩短分析时间，提高灵敏度。综合考虑单糖和功能性低聚糖灵敏度、峰形及分析时间，通过实验确定梯度洗脱条件见表1。

3.2 色谱柱选择

本试验采用CarboPacTMPA20色谱柱对4种单糖和9种功能性低聚糖进行分离，效果较好。采用PA10、PA1色谱柱对单糖和功能性低聚糖进行检测，结果显示，单糖分离效果没有太大变化，但各低聚糖的保留时间明显延长，蔗果三糖～蔗果九糖色谱峰均出现拖尾。与PA20色谱柱相比，PA1、PA10色谱柱粒径稍大，柱效明显低于PA20，故选择PA20色谱柱作为分析柱。单糖和功能性低聚糖标准溶液的离子色谱图见图1。

图1 单糖和功能性低聚糖对照品溶液的离子色谱图

由图1可见，在优化的梯度洗脱条件下，采用CarboPacTMPA20色谱柱实现了4个单糖和9个功能性低聚糖的基线分离。

3.3 样品前处理沉淀试剂选择

糖极易溶于水，故采用水作为提取溶剂，为了沉淀奶粉中的蛋白质，需在提取溶剂中加入一定比例沉淀试剂。依据参考文献，本实验先后选用亚铁氰化钾和乙酸锌蛋白、乙腈、3 %乙酸作为沉淀试剂。采用乙腈、亚铁氰化钾和乙酸锌蛋白沉淀试剂，提取效果不好，样品回收率低，因此选用3 %乙酸作为沉淀试剂，考察加入不同体积的3 %乙酸，结果显示水-3 %乙酸体积比为5:1时样品提取完全，提取效果满意。

3.4 标准曲线和检出限结果

按2.1项方法配制5个水平的混合对照品溶液，并在优化的色谱条件下进行检测。以目标化合物的峰面积电信号（y）作为纵坐标、质量浓度（x，mg/L）为横坐标绘制曲线，见表3。4个单糖线性范围为0.1～5 mg/L，9个功能性低聚糖的线性范围为0.2～10 mg/L，相关系数r均大于0.996，线性关系良好，检出限为2 mg/100 g。

表3 标准曲线和检出限结果

3.5 回收率和精密度

向空白样品中添加4种单糖和9中功能性低聚糖对照品储备液，制备含量分别为10，25，50 mg/100 g的加标样品，按2.3项处理方法及2.4项测定条件进行回收率试验，每个添加水平平行测定，结果见表4。各化合物的平均回收率为82.0 %～106.1 %，RSD为2.7 %～8.9 %。

表4 回收率试验结果

3.6 实际样品检测

采用本试验建立的离子色谱方法，对市场上销售的不同品牌的婴幼儿奶粉中的糖含量进行了检测。10批次婴幼儿配方奶粉样品中功能性低聚糖含量约在400～600 mg/100 g范围内。

试验结果显示，目前市场上销售的婴幼儿配方奶粉中检出棉子糖、水苏糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖等功能性低聚糖，蔗果七糖及以上低聚糖在少数奶粉品牌中有检出，这可能跟原料的工艺有关，进而导致加到奶粉中的蔗果七糖及以上的低聚糖含量较低。

4 讨论

本试验通过采用离子色谱-金电极脉冲安培法，选用灵敏度高的CarboPacTMPA20色谱柱，建立快速定量检测样品中单糖、棉子糖、水苏糖和功能性低聚果糖含量的方法。通过对样品前处理条件和离子色谱参数优化，实现了4种单糖和9种功能性低聚糖的同时分离检测。该方法适用于婴幼儿配方奶粉中单糖及低聚糖的检测，具有较高的应用价值。