枇杷叶胶囊的制备及质量标准研究

（惠州卫生职业技术学院 药学系，广东 惠州 516025）

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷的干燥叶，别名巴叶、芦橘叶，全年均可采收[1]。《中药大辞典》记载道：枇杷叶具有清肺和胃、降气化痰功能，是治疗肺热咳喘的要药[2]。因其独特的药用价值，在现代医学中的应用也非常普遍。枇杷叶中的化学成分多样，目前从中分离出来的成分主要有三萜酸类、黄酮类、挥发油、有机酸类、多酚类、皂苷类等[3]。目前药理研究表明其主要有效成分集中在三萜酸类化合物[4]，具有良好的镇咳、祛痰和平喘等作用[5]，三萜酸中以熊果酸和齐墩果酸的含量最高[6]，可作为枇杷叶的质量评价指标[7]。百姓素有使用枇杷叶水煎液的习惯，但其存在着不易保存、不便携带等不足之处。中药胶囊剂具有质量稳定、易存储、使用和运输方便等优点。课题组前期已以熊果酸和齐墩果酸为指标，对枇杷叶进行了提取工艺的优选[8]，本研究以流动性、吸湿性、成型性[9]、辅料用量为考察指标，确定枇杷叶胶囊的最佳制备工艺，并初步建立简单可行的枇杷叶胶囊质量标准，为其进一步产业化研发提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JA3003电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；BPG-9240A鼓风干燥箱（上海百典仪器设备有限公司）；BJ-3崩解时限测试仪（郑州南北仪器设备有限公司）；PS-40A超声波清洁机（深圳市科洁超声科技有限公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Thermo ODS-2 Hypersil色谱柱（赛默飞世尔科技公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（郑州博科仪器设备有限公司）。

1.2 试剂与试药

淀粉，糖粉，微晶纤维素，可溶性淀粉（山东聊城华阳医药辅料有限公司）；乳糖，醋酸铵（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；甲苯，丙酮（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；硫酸，无水乙醇（分析纯，台山市粤侨试剂塑料有限公司）；乙腈，甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水（蒸馏水，屈臣氏饮用水有限公司）；熊果酸对照品，齐墩果酸对照品（北京世纪奥科生物技术有限公司）；枇杷叶对照药材（上海一研生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 辅料的选择

因枇杷叶浓缩液真空干燥后成块状黏连固体，不利于进一步制剂，故选择湿法制粒后，再填充胶囊。

2.1.1 单一辅料的考察 取5份枇杷叶稠膏，各5 g，分别加入一定量的淀粉、可溶性淀粉、乳糖、糖粉、微晶纤维素，混合制粒，以辅料用量、休止角、吸湿率、成型状态为指标，考察结果见表1。由表1可见，淀粉的流动性最好，乳糖的吸湿性最好。但乳糖和糖粉用量大，会增大药品的服用量，故排除乳糖和糖粉；可溶性淀粉不易混合均匀；淀粉用量稍大，颗粒细粉多，但价格低廉；微晶纤维素用量少，颗粒细粉多，价格较高。综合以上因素，不宜使用单一辅料进行制剂，需进一步对配伍辅料进行考察。

表1 单一辅料考察结果

2.1.2 配伍辅料的考察 取5份枇杷叶稠膏，各5 g，加入不同比例的微晶纤维素和淀粉进行制粒，以辅料用量、休止角、吸湿率、成型状态为指标，考察结果见表2。由表2可见，各配比辅料制得的颗粒流动性均符合制剂要求，各比例的吸湿性差别不大，结合考虑辅料用量和成型性两因素，确定选用微晶纤维素与淀粉配比为1:1作为辅料制粒，稠膏与辅料的比例约为1:1。

表2 配伍辅料考察结果

2.2 胶囊壳的选择

2.2.1 堆密度测定 取颗粒3份，各约4 g，精密称定，填充于10 ml量筒中，由5 cm高度处落在木板上，反复振动3次后，测定颗粒的体积（V），根据公式ρ=m/V计算堆密度，测得堆密度分别为0.409，0.411，0.407 g/ml，均值为0.409 g/ml。

2.2.2 胶囊壳的装量 按2015年版《中国药典》[10]，枇杷叶药材的使用量为6～10 g，药材中熊果酸和齐墩果酸总含量不低于0.70 %折算，设计以每粒胶囊应含熊果酸和齐墩果酸不得少于5 mg，每人每天服用3次，每次3粒计算，通过预测试颗粒的含量，推测出每粒胶囊约装0.2 g。结合堆密度的测定结果，根据胶囊壳型号和近似容积的关系，选择1号空心胶囊（近似容积为0.5 ml）分装。

2.3 枇杷叶胶囊制备

取枇杷叶690 g，采用80 %乙醇提取，液料比为12:1，回流提取2次，每次1 h[8]。80 ℃减压浓缩，得稠膏约138 g，相对密度约为1.24，加入辅料[微晶纤维素-淀粉（1:1）]140 g，制粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。

2.4 胶囊剂的检查

根据2015年版《中国药典》对胶囊剂的要求，对胶囊剂作外观、水分、装量差异、崩解时限检查[11]。

2.4.1 外观与性状 胶囊外观整洁，无黏结、变形及破裂现象，无异味；内容物为黄褐色颗粒，味微苦，颗粒干燥，松紧适度，色泽一致。

2.4.2 水分 取3批枇杷叶胶囊内容物各2份，每份约2 g，按《中国药典》2015年版相关规定[11]进行检查，结果显示均符合要求，见表3。

2.4.3 装量差异的检查 从3批枇杷叶胶囊中随机抽取10粒，按《中国药典》2015年版相关规定[11]进行检查，结果显示均符合要求，见表3。

2.4.4 崩解时限的检查 取3批枇杷叶胶囊，每批6粒，按《中国药典》2015年版相关规定[11]进行检查，结果显示均符合要求，见表3。

表3 3批枇杷叶胶囊检查结果

2.5 定性鉴别

2.5.1 供试品溶液制备 取3批枇杷叶胶囊内容物适量，研细，各取1 g，分别加甲醇20 ml，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，即得。

2.5.2 对照药材溶液制备 取枇杷叶对照药材1 g，加甲醇20 ml，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，即得。

2.5.3 对照品溶液制备 取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1 ml含熊果酸1 mg的溶液，即得。

2.5.4 阴性供试品溶液制备 按处方取辅料1 g，准确称定，加甲醇20 ml，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，即得。

2.5.5 薄层色谱（TLC）鉴别 吸取3批供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性供试品溶液各1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（5:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图1。由图1可见，供试品、对照品、对照药材色谱在相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性供试品基本无干扰。

图1 枇杷叶胶囊TLC鉴别

2.6 含量测定

2.6.1 色谱条件 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.5 %醋酸铵溶液（73:12:15）；检测波长：210 nm；流速：1.0 ml/min；理论塔板数按熊果酸峰计算应不低于5000[8]。

2.6.2 对照品溶液制备

2.6.2.1 熊果酸对照品储备液的制备 取熊果酸对照品适量，加乙醇，制成每1 ml含熊果酸3.080 mg的对照品储备液。

2.6.2.2 齐墩果酸对照品储备液的制备 取果齐墩酸对照品适量，加乙醇，制成每1 ml含齐墩果酸1.160 mg的对照品储备液。

2.6.2.3 混合对照品溶液制备 分别取熊果酸对照品储备液、齐墩果酸对照品储备液适量，置于10 ml量瓶中，以乙醇定容，得到含熊果酸1.540 mg/ml、齐墩果酸0.580 mg/ml的混合对照品溶液。

2.6.3 供试品溶液制备 取枇杷叶胶囊内容物适量，研细，取0.2 g，精密称定，置于10 ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.6.4 空白溶液制备 按处方取辅料1 g，精密称定，置于10 ml量瓶中，加入乙醇适量，超声处理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.6.5 专属性考察 取供试品溶液、混合对照品溶液及空白溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，按2.6.1项色谱条件进样检测，结果见图2。由图2可见，齐墩果酸和熊果酸出峰时间适宜，峰形良好，空白溶液无干扰。

图2 专属性考察HPLC图谱

2.6.6 线性关系考察 分别精密吸取熊果酸对照品储备液和齐墩果酸对照品储备液各0.625，1.25，2.5，5，10 ml，置20 ml量瓶中，以乙醇定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液，取系列混合对照品溶液各10 μl，按2.6.1项色谱条件进样分析。以系列混合对照品溶液浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，进行回归计算，得熊果酸回归方程y=3048.3x+0.9007（r=0.9999），在浓度为0.096～1.540 mg/ml时线性关系良好；齐墩果酸回归方程y=4754.9x-17.269（r=0.9998），在浓度为0.036～0.580 mg/ml时线性关系良好。

2.6.7 精密度考察 取供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，按2.6.1项色谱条件进样测定，熊果酸和齐墩果酸峰面积RSD值均为0.40 %，表明仪器精密度良好。

2.6.8 稳定性考察 取供试品溶液，室温下放置，分别于0，6，12，30，48，72 h进样10 μl，测得熊果酸和齐墩果酸的色谱峰面积RSD值分别为2.35 %，2.34 %，表明供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.6.9 重复性考察 取供试品溶液 6份，各10 μl，按2.6.1项色谱条件进样分析。测得熊果酸和齐墩果酸两者总含量RSD为2.61 %，表明该方法重复性良好。

2.6.10 加样回收率考察 取已知含量的枇杷叶胶囊内容物9份，研细，称取0.1 g，精密称定，置10 ml量瓶中，分为3组，每组分别加入齐墩果酸对照品溶液0.4，0.6，1.2 ml和熊果酸0.8，1.0，1.2 ml，加入乙醇适量，超声处理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液各10 μl，注入液相色谱仪，按2.6.1项色谱条件测定齐墩果酸峰面积积分值，计算回收率和RSD值。结果见表4、表5。

表4 齐墩果酸加样回收率试验结果

表5 熊果酸加样回收率试验结果

2.6.11 样品中熊果酸和齐墩果酸含量的测定 取3批样品，按2.6.2和2.6.3项下方法分别配制对照品和供试品溶液，每批平行测定3份，测定结果见表6。

表6 样品中熊果酸和齐墩果酸含量

3 讨论

本文通过辅料用量、吸湿性、流动性、成型性对制剂的辅料进行筛选，最终确定选用微晶纤维素、淀粉，两者配比为1:1；通过堆密度实验，并依据2015年版《中国药典》中枇杷叶的使用量进行折算，选定1号空心胶囊进行填充。

因枇杷叶胶囊是枇杷叶的单方制剂，故首选2015年版《中国药典》枇杷叶药材项下的方法对枇杷叶胶囊进行鉴定，结果显示斑点清晰，分离效果好。多次试验结果表明方法重现性好。

熊果酸和齐墩果酸是枇杷叶中含量最高的三萜酸类成分，而三萜酸是枇杷叶抗炎止咳的主要成分，因此选定熊果酸和齐墩果酸为枇杷叶胶囊的定量指标。采用HPLC法建立了枇杷叶胶囊中熊果酸和齐墩果的含量测定方法，并进行了方法学考察，考察结果表明该方法专属性好、重现性好、稳定性好、回收率良好。本方法可有效地控制枇杷叶胶囊的质量。

通过上述枇杷叶胶囊的一般检查（外观性状、水分、崩解时限、装量差异）结果、TLC鉴别方法的确定、含量测定方法的建立及3批样的含量验证，为枇杷叶胶囊的质量标准拟定提供了数据支持，同时为枇杷叶胶囊的质量可控提供了保证。