接种丛枝菌根真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵生长及盐离子积累的影响

2021-05-18贾冰冰周昕南丁胜利史中奇郝利君

华南农业大学学报 2021年3期

贾冰冰，周昕南，丁胜利，史中奇，郝利君，许静，郭伟

(内蒙古大学生态与环境学院/蒙古高原生态学与资源利用教育部重点实验室/内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室，内蒙古呼和浩特 010021)

目前土壤盐碱化问题日益严重，全球每年受盐碱化影响的农田土地面积约为30～150万hm2[1]。在中国，各类盐碱土面积总计约为9 900万hm2[2]，其中内蒙古是我国盐碱化较为严重的区域，盐碱化土壤面积达到了7.63×106hm2，约为全区耕地面积的104%[3]。自然界中盐碱土的盐分组成主要包括NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3等[4]。在内蒙古中东部区域形成的盐碱土，其主要类型是NaCl、NaCl+Na2SO4、NaCl+NaHCO3[5]；在西部区域形成的盐碱土，其主要类型是NaCl+Na2SO4[6]。随着社会发展，对耕地面积的需求增大，土壤盐碱化问题已经严重危害生态环境与农牧业发展，寻求有效环保又经济的开发利用和修复方法已成为当前社会迫切的需求。目前，生物改良方法之一是将盐碱地开发利用与作物种植计划相结合，选择合适的耐盐作物，在种植与生长过程中既改良了盐碱化土地又使土地利用率实现最大化，生态修复的同时又可发展经济[7]。

向日葵Helianthusannuus生长周期短，经济价值高，具有一定的耐盐碱、抗干旱能力，在内蒙古地区大面积种植[8]。有研究在盐碱土的实际改良中选用向日葵进行种植[9]，获得了较好的改良效果和经济效益[10]，因此可选用向日葵作为植物品种对盐碱化土壤进行开发利用和植物修复[11]。同时研究表明，只有低浓度(质量分数≤0.35%)盐胁迫对向日葵的生长没有明显的抑制作用，随着盐分浓度的升高，会影响向日葵的细胞膜透性和光合作用等，从而造成对向日葵生长的损伤，并随盐逆境时间延长损伤加重[12-13]。丛枝菌根 (Arbuscular mycorrhiza，AM)真菌是自然界普遍存在的一种最古老的共生微生物，与植物共生后可显著增加植物的抗逆能力[14]。在盐碱胁迫下，AM真菌可通过改善土壤环境，改变植物根系形态，增加植物对养分和水分的吸收利用，增强植物对盐碱胁迫的耐受程度，改善植物的生长[15]。赵霞等[16]研究发现AM真菌摩西球囊霉Glomusmosseae可以有效提高盐碱胁迫下紫花苜蓿Medicagosativa的渗透调节物质，减轻膜脂过氧化伤害，增强其抗盐碱能力。同时叶林[17]发现，与其他菌种相比，接种摩西球囊霉西瓜Citrulluslanatus幼苗的耐盐碱能力的综合表现最好。因此，接种AM真菌可有利于增强向日葵的耐盐碱性，减少盐分对其的毒害作用，使向日葵可以更好地适应盐碱胁迫，在盐碱土壤环境中更好地生长。目前，国内外有关接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵生长和盐分离子积累的研究鲜有报道，其研究结果对于开发利用和修复我国不同类型盐碱化土壤具有十分重要的科学意义和潜在应用前景。

本试验采用温室盆栽的方法，研究接种AM真菌摩西斗管囊霉Funneliformismosseae对3种不同类型盐碱胁迫 (NaCl、NaCl+Na2SO4、NaCl+NaHCO3)下向日葵菌根侵染率、植株生物量、营养元素吸收、C∶N∶P化学计量比、Na+吸收积累、光合作用和细胞膜透性等指标的影响，探讨接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵生长和盐分离子积累的影响，旨在为我国不同类型盐碱化土壤的开发利用和生物修复提供新的研究思路和技术方法。

1 材料与方法

1.1 培养基质

供试土壤是非盐碱化土壤，水溶性盐总量(w)为0.25 g·kg−1，取自内蒙古自治区呼和浩特市(40°48′N，111°43′E)。土壤 pH为7.39，电导率为115.93 μs·cm−1，有机质质量分数为13.9 g·kg−1，全氮、全磷、全钾质量分数分别为0.80、0.70、18.30 g·kg−1，碱解氮、有效磷和速效钾质量分数分别为40.50、3.93 和 76.00 mg·kg−1。采集的土壤自然风干后过 2 mm 土壤筛，121 ℃ 下高压蒸汽灭菌 2 h，用以杀灭土著微生物。

1.2 供试植物和菌种

供试向日葵品种为山西美葵，种子由内蒙古农牧科学研究院提供，质量分数为10%的H2O2溶液消毒催芽后播种。供试菌种为F.mosseae(BGC NM02A，1511C0001BGCAM0045)，购于北京市农林科学院植物营养与资源研究所。接种菌剂为玉米Zeamays作为宿主植物繁殖而得到的根际砂土混合物(砂土比为1∶1)，其中包括真菌孢子、菌丝和宿主植物繁殖体，每10 g接种菌剂中含有282个孢子。

1.3 试验设计

在内蒙古大学温室内进行盆栽试验。设置1个对照(CK)和3种类型的盐碱胁迫处理(NaCl、NaCl+Na2SO4、NaCl+NaHCO3)，具体处理见表 1，对CK和不同盐碱胁迫处理均进行不接种处理和接种F.mosseae处理，共8种处理，每个处理重复4次，共计32盆，随机排列摆放。试验采用塑料花盆为容器，每盆装2 kg高压蒸汽灭菌后的预处理土壤，接种F.mosseae处理加入50 g菌剂，不接种处理加入50 g灭菌菌剂。每盆播种6颗向日葵种子，出苗1周后保留长势一致的3株幼苗，6周后开始进行盐碱胁迫处理，分5次浇灌，每隔3 d处理1次，每次每盆加入100 mL溶液。向日葵自出苗开始生长10周后收获。植物在试验过程中自然采光，采用称重法浇水，以使土壤含水量保持在田间最大持水量的80%。

表 1 盐碱处理的设计方案1)Table 1 Experimental design of saline-alkali treatments

1.4 样品制备及分析测定

盐碱胁迫处理结束后，向日葵生长至8周时，使用便携式光合测定仪(GFS-3000，WALZ，德国)选取相同位置的向日葵叶片测定光合指标：蒸腾速率(Tr)、净光合速率(Pn)、叶片气孔导度(Gs)和胞间二氧化碳浓度(Ci)。收获前，取0.25 g新鲜的向日葵叶片，剪碎放入装有20 mL蒸馏水的烧杯中，同时设置1个空白(即不放入叶片的蒸馏水)，在25 ℃恒温1 h后取出，用电导率仪(SevenCompact S230，Mettler Toledo，瑞士)测定溶液的电导率；再将烧杯放置于100 ℃沸水浴中20 min，测定冷却后溶液的电导率。细胞膜透性即为相对电导率[18]，其公式如下：

收获时，使用蒸馏水反复多次冲洗植物，称量每盆向日葵茎叶和根系鲜质量，70 ℃烘箱中烘至恒质量后再称量各盆干质量。随机选取0.5 g向日葵新鲜根系，保存在体积分数为50%的乙醇溶液中，用质量分数为10%的KOH溶液脱色处理，于乳酸甘油溶液中用质量分数为0.05%的台盼蓝染色，将染色剂冲洗干净后制片，利用根段频率法计算菌根侵染率。

向日葵样品烘干后进行粉碎处理，取2～3 mg粉碎后植物样品，利用元素分析仪(Vario ELIII，Elementar，德国)测定其茎叶和根系C和N含量。取0.5 g粉碎后植物样品，于 120 ℃ 加入5 mL HNO3(BV-Ⅲ级)经开放式消煮后，利用电感耦合等离子体发射光谱仪 (Optima 7000DV，PerkinElmer，美国)测定消煮液中 K、P、Ca2+、Mg2+和 Na+含量。Na+积累量公式如下：

1.5 数据分析

使用Excel 2003计算所有试验数据平均值和标准误；使用SPSS 22.0软件采用Duncan’s法分析不同处理间的差异显著性，呈现非正态分布的数据(菌根侵染率)经过反正弦转换后用上述方法进行分析，利用双因子方差分析不同类型盐碱胁迫处理和接种AM真菌的交互作用对测定指标的影响；使用OriginPro 2018软件绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 向日葵根系菌根侵染率和生长情况

接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵根系侵染率和生长的影响如图1所示。不接种处理组向日葵根系均未受到菌根真菌的侵染，接种F.mosseae处理组向日葵根系菌根侵染率为16.95%～32.17%。与对照相比，不同类型的盐碱胁迫使向日葵菌根侵染率降低了29.53%～47.31%(P<0.05)，不同类型盐碱胁迫处理间向日葵菌根侵染率无显著差异。双因素分析表明，不同类型盐碱胁迫和接种AM真菌的交互作用对菌根侵染率有显著影响(P<0.05)。

图 1 接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵根系菌根侵染率和生长的影响Fig.1 Effects of AM fungi inoculation on the root infection rate and growth of sunflower under different types of salinealkali stress

由图1可知，无论是否接种AM真菌，不同类型盐碱胁迫处理使得向日葵茎叶干质量、根系干质量和总干质量呈现下降趋势，但没有达到显著水平。接种AM真菌处理组，NaCl+NaHCO3处理使向日葵根系干质量显著高于NaCl和NaCl+Na2SO4处理(P<0.05)。与不接种处理相比，接种AM真菌使NaCl+NaHCO3处理向日葵茎叶干质量、根系干质量和总干质量分别提高了55.20%、89.94%和60.35%(P<0.05)。双因素分析表明，不同类型盐碱胁迫和接种AM真菌的交互作用对向日葵干质量无显著影响。

2.2 向日葵营养元素吸收

接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵N、P、K、Ca2+、Mg2+含量的影响如图 2所示。不接种AM真菌处理组，与对照相比，NaCl处理使向日葵根系的P含量显著升高，NaCl+Na2SO4处理使茎叶的P含量显著升高，NaCl+NaHCO3处理使茎叶的Mg2+含量显著升高，根系的K含量显著减少(P<0.05)。接种AM真菌处理组，与对照相比，NaCl+NaHCO3处理使根系K含量显著减少(P<0.05)，3种盐碱胁迫处理均使根系Mg2+含量显著减少(P<0.05)。与不接种处理相比，接种AM真菌使对照、NaCl和NaCl+NaHCO3处理向日葵茎叶P质量分数分别升高了82.50%、71.11%和74.47%，使对照和NaCl+NaHCO3处理根系P质量分数分别升高了61.54%和88.37%，使NaCl+NaHCO3处理茎叶 N、Ca2+、Mg2+质量分数分别减少了39.65%、25.62%和36.34%(P<0.05)。双因素分析表明，不同类型盐碱胁迫和接种AM真菌的交互作用仅对向日葵茎叶Mg2+含量具有显著影响(P<0.05)。

图 2 接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵茎叶和根系元素含量的影响Fig.2 Effects of AM fungi inoculation on the contents of elements in shoot and root of sunflower under different types of saline-alkali stress

2.3 向日葵C∶N∶P化学计量比

接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵C∶N∶P化学计量比的影响如图3所示。不接种AM真菌处理组，与对照相比，NaCl处理使得向日葵根系C∶P和N∶P显著减小，NaCl+Na2SO4处理使得向日葵茎叶C∶P和N∶P显著减小(P<0.05)。与不接种处理相比，接种AM真菌使得对照和NaCl+NaHCO3处理向日葵茎叶和根系C∶P和N∶P显著减小，使得NaCl处理茎叶C∶P和N∶P显著减小(P<0.05)。双因素分析表明，不同类型盐碱胁迫和接种AM真菌的交互作用仅对向日葵根系N∶P具有显著影响(P<0.05)。

图 3 接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵茎叶和根系C∶N∶P的影响Fig.3 Effects of AM fungi inoculation on C∶N∶P ratios in shoot and root of sunflower under different types of salinealkali stress

2.4 向日葵Na+吸收积累

接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵Na+吸收积累的影响如图4所示。不接种AM真菌处理组，与对照相比，3种盐碱处理使向日葵根系Na+质量分数提高了200.16%～245.30%，Na+积累量提高了83.68%～179.78%(P<0.05)。接种AM真菌处理组，与对照相比，NaCl和NaCl+NaHCO3处理使得茎叶Na+质量分数分别提高了250.00%和175.00%，使Na+积累量提高了234.84%和183.26% (P<0.05)；3种盐碱处理使向日葵根系Na+质量分数提高了167.19%～229.33%，Na+积累量提高了113.25%～203.31%(P<0.05)；与 NaCl相比，NaCl+Na2SO4处理使茎叶Na+质量分数和积累量分别降低50.00%和56.22%(P<0.05)。与不接种处理相比，接种AM真菌使NaCl+Na2SO4和NaCl+NaHCO3处理根系Na+积累量分别提高了74.20%和82.25%(P<0.05)。双因素分析表明，不同类型盐碱胁迫和接种AM真菌的交互作用对向日葵Na+含量和积累量均无显著影响。

图 4 接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵茎叶和根系Na+含量和积累量的影响Fig.4 Effects of AM fungi inoculation on contents and accumulations of Na+ in shoot and root of sunflower under different types of saline-alkali stress

2.5 向日葵光合作用

接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵叶片光合指标的影响如图5所示。不接种AM真菌处理组，与对照相比，NaCl处理使得向日葵叶片蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)显著降低，NaCl+Na2SO4处理使得Ci显著降低；与NaCl相比，NaCl+Na2SO4处理使得叶片Tr和Gs显著提高，NaCl+NaHCO3处理使得叶片Tr、Gs、Ci显著提高(P<0.05)。接种AM真菌处理组，与对照相比，NaCl+Na2SO4和NaCl+NaHCO3处理使叶片Tr显著提高，NaCl处理使Ci显著降低，NaCl+NaHCO3处理使Gs显著提高；与NaCl相比，NaCl+NaHCO3处理使Tr显著提高，NaCl+Na2SO4和NaCl+NaHCO3处理使Ci显著提高，NaCl+NaHCO3处理使Gs显著提高(P<0.05)。与不接种处理相比，接种AM真菌使4种处理净光合速率(Pn)均呈上升趋势，但差异没有达到显著水平；使对照处理叶片Tr和Gs分别降低11.26%和13.64%，使NaCl和NaCl+NaHCO3处理叶片Tr提高了11.67%和10.12%，使NaCl+NaHCO3处理叶片Gs提高20.00%(P<0.05)。双因素分析表明，不同类型盐碱胁迫和接种AM真菌的交互作用仅对向日葵Tr和Gs具有非常显著影响(P<0.01)。

图 5 接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵光合指标的影响Fig.5 Effects of AM fungi inoculation on photosynthesis indexes of sunflower under different types of saline-alkali stress

2.6 向日葵细胞膜透性

接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵叶片细胞膜透性的影响如图6所示。不接种AM真菌处理组，在不同类型盐碱处理下细胞膜透性均有下降趋势，但差异均未达显著水平。接种AM真菌处理组，与对照和NaCl处理相比，NaCl+NaHCO3处理向日葵叶片细胞膜透性分别降低44.23%和51.60%(P<0.05)。与不接种处理相比，接种AM真菌使NaCl+NaHCO3处理向日葵叶片细胞膜透性降低51.49%(P<0.05)。双因素分析表明，不同类型盐碱胁迫和接种AM真菌的交互作用对向日葵细胞膜透性无显著影响。

图 6 接种AM真菌对不同类型盐碱胁迫下向日葵细胞膜透性的影响Fig.6 Effects of AM fungi inoculation on the cell membrane permeability of sunflower under different types of saline-alkali stress

3 讨论

侵染率可表示宿主植物与AM真菌间的共生关系，常用于评估AM真菌对环境的适应程度[19]。本研究显示，接种F.mosseae的向日葵根系的菌根侵染率在3种类型盐碱胁迫处理下均显著下降，抑制程度为NaCl+Na2SO4＞NaCl＞NaCl+NaHCO3，但处理间无显著差异。Lin等[20]研究表明，在100 mmol/L NaCl和 NaHCO3处理时接种G.mosseae的羊草Leymuschinensis菌根侵染率分别降低了5.48%和18.49%。张良等[21]的研究发现，200 mmol·L−1NaCl和 100 mmol·L−1NaHCO3处理使接种F.mosseae的星星草Puccinelliatenuiflora根系泡囊丰度分别减少了11.70%和12.71%，NaHCO3胁迫处理对羊草和星星草菌根侵染率的抑制作用明显高于NaCl。马忠莉等[22]研究发现，在相同盐碱土中AM真菌对羊草和虎尾草Chlorisvirgata根系的侵染率分别为19.8%和34.0%。研究表明，不同盐种类对AM真菌孢子萌发的影响存在显著的差异[23]，因此盐碱胁迫处理对植物菌根侵染率的抑制作用与盐碱类型直接相关，同时还受到植物种类的影响。

盐碱胁迫会通过渗透和特定的离子效应导致植物二次氧化应激，从而影响植物的生长，减少植物的生物量[1]。本研究结果显示，3种类型的盐碱胁迫处理均抑制了向日葵的生长，抑制程度为NaCl+Na2SO4＞NaCl+NaHCO3＞NaCl，但处理间没有显著性差异。李玉梅[24]的研究发现，牛叠肚Rubus crataegifolius幼苗生物量在 60 mmol·L−1NaCl、Na2SO4和NaHCO3胁迫下分别降低27.98%、29.10%和2.69%。研究表明，盐碱胁迫环境中植物在AM真菌的作用下可通过摄取更多的矿质养分P和水分，诱导抗氧化酶系统活性，调节植物激素水平，保护光合器官等途径[25]，促进植物更好的生长。Lin等[20]的研究发现，接种G.mosseae的羊草在200 mmol·L−1NaCl和 NaHCO3处理下生物量分别增加29.17%和10.00%。本研究结果显示，在3种类型的盐碱胁迫处理下接种F.mosseae均在一定程度上改善了向日葵的生长状况，增加程度为NaCl+NaHCO3＞NaCl+Na2SO4＞NaCl，但仅在NaCl+NaHCO3处理下接种AM真菌显著增加向日葵的生物量，表明AM真菌对于向日葵抵抗NaCl+NaHCO3胁迫的接种效果最好。分析相关研究结果，可能与NaCl+NaHCO3胁迫时接种AM真菌F.mosseae显著促进向日葵对矿质营养元素P的吸收，提高叶片蒸腾速率和气孔导度，降低叶片细胞膜透性等作用相关。

N、P和K等是植物体新陈代谢和生长发育的必需营养元素，可增强植物体的抗逆境胁迫能力，使得植物能更好的适应复杂的外界环境[26]。在本研究中，接种F.mosseae使NaCl+NaHCO3处理向日葵茎叶和根系P含量均显著增加，使NaCl处理向日葵仅茎叶P含量显著增加，而没有显著影响NaCl+Na2SO4处理向日葵植株P含量，表明接种AM真菌对不同盐碱胁迫处理下植物营养元素吸收的影响存在显著的差异。陈飞等[27]的研究取得了相似的结果，200 mmol·L−1NaCl或 NaHCO3处理时接种Rhizophagusintraraduces或F.mosseae使星星草地上部P含量增加42.42%～54.32%。研究表明，AM真菌菌丝可分泌碱性磷酸酶和酸性磷酸酶使土壤有效态P含量显著提高，且能在较低阈值下对P进行吸收，显著提高植物P的获取量，其菌丝最多可提供植物生长所需P的80%[1]。

本研究结果显示，在3种类型盐碱胁迫处理下向日葵茎叶和根系Na+含量和积累量均呈增加趋势，但仅根系为显著性增加，且处理间无显著性差异。Garg 等[28]研究显示，0～100 mmol·L−1NaCl处理时，鹰嘴豆Cicerarietinum植株内Na+含量呈线性增长，且相比于叶更优先分配于根中。遆晋松等[29]研究发现，盐碱胁迫环境中向日葵对盐分离子具有一定的区隔化能力，阻止Na+向植株地上部转运，减轻盐分离子对植物生长的毒害作用。另外，有研究表明菌根植物可控制Na+向地上转运，其原因是可将Na+隔离在液泡中或将其从胞质中排出，而且在盐碱条件下菌根植物比非菌根植物更易促进宿主植物从木质部吸收Na+，并将其从光合组织中转移到根部[1]。本研究显示接种F.mosseae使得NaCl+Na2SO4和NaCl+NaHCO3处理向日葵茎叶和根系Na+积累量所有增加，表明AM真菌改善了向日葵对土壤中Na+的吸收和积累，有助于提高盐碱化土壤的植物修复效率。

光合作用可以反映植物体对非生物胁迫的生理敏感性[30]。Hashem 等[31]研究发现，200 mmol·L−1NaCl处理显著降低了黄瓜Cucumissativus叶片的Gs，Lin 等[30]在 100 和 200 mmol·L−1NaCl或NaHCO3胁迫对羊草光合作用影响的研究中得到了类似的结果。本研究显示，不接种AM真菌时3种类型盐碱胁迫处理使向日葵叶片Gs和Tr均有所下降，但仅在NaCl处理时为显著降低，Ci仅在NaCl和NaCl+Na2SO4处理时显著下降，表明NaCl+NaHCO3处理对向日葵光合作用的抑制小于NaCl和NaCl+Na2SO4处理。同时Lin等[30]的研究中，在 100 和 200 mmol·L−1NaCl或 NaHCO3处理下，接种AM真菌G.mosseae使羊草的Pn、Ci和Gs均显著增加。在本研究中，接种AM真菌使3种盐碱处理下向日葵Pn、Tr和Gs均呈现升高的趋势，但仅使NaCl和NaCl+NaHCO3处理向日葵Tr和NaCl+NaHCO3处理向日葵Gs显著增加。研究表明，AM真菌可改善植物内水分状况，保持较高的气孔导度[32]，增强植物气体交换能力，有助于植物光合速率的提高[30]。

植物细胞膜负责对细胞内外物质的交换进行控制与调节[33]，在盐碱胁迫环境下由于渗透作用会导致细胞胞液外渗，使相对电导率增加，故细胞膜受损程度可利用相对电导率表示[34]。岳英男[34]的研究发现，在质量分数为0.5%和1.0%的NaCl溶液处理时接种Glomusintraradice和Glomusversiforme混合菌的紫花苜蓿Medicagosativa的细胞膜透性相比于不接种显著降低。陈飞[35]在AM真菌对星星草生理代谢的影响研究中发现，在 0～400 mmol·L−1NaCl或NaHCO3胁迫下接种F.mosseae使星星草的细胞膜透性下降了6.42%～25.82%。与以上研究结果相似，本研究中接种AM真菌使得NaCl+NaHCO3和NaCl+Na2SO4处理向日葵细胞膜透性分别降低51.49%和34.59%，表明AM真菌可以降低植物叶片的膜质透性，从而降低植物细胞膜的受损程度，减轻不同盐碱胁迫对于植物的毒害作用。