结肠生物钟基因Bmal1在腹泻型肠易激综合征症状发生中的作用及其机制研究*

王彦钧 曾玮玮 朱建儒 王 静 李素霞 陈东风 邓天伟 杨 敏&

陆军军医大学陆军特色医学中心大坪医院消化内科1(400042)北京大学中国药物依赖性研究所2 重庆大学附属三峡医院消化内科3

背景：腹泻型肠易激综合征(IBS-D)患者的症状具有昼夜波动等节律紊乱特征，但其病理生理学机制尚不清楚。目的：探讨结肠生物钟基因Bmal1在IBS-D患者症状发生中的作用及其可能机制。方法：于2018年9月—2021年2月在陆军特色医学中心纳入46例IBS-D患者和34例正常对照者参与研究。以IBS严重程度评分系统(IBS-SSS)评估患者病情严重程度。结肠镜检查时在直肠乙状结肠交界处取活检，以ELISA法检测5-羟色胺(5-HT)含量，免疫荧光双标技术检测Bmal1和肠嗜铬细胞(EC细胞)标记物嗜铬粒蛋白A(CgA)表达。结果：IBS-D患者结肠黏膜中的5-HT含量、EC细胞数量均显著高于正常对照组(P均<0.05)。Bmal1主要表达于肠上皮细胞，其与CgA存在共表达，且在EC细胞中呈高表达。与同时间点取材的正常对照组相比，上午9∶00取材的IBS-D患者结肠Bmal1表达显著升高，下午17∶00取材者Bmal1表达则显著降低(P均<0.05)。Spearman相关系数分析显示，上午9∶00取材的IBS-D患者结肠Bmal1表达与IBS-SSS总分和腹痛不适评分呈显著正相关(rs=0.413, P=0.023; rs=0.546, P=0.001)。结论：IBS-D患者存在结肠生物钟基因Bmal1表达紊乱，Bmal1振荡或可通过影响EC细胞的5-HT分泌参与IBS-D症状发生。

肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一种常见的功能性胃肠病，不同研究报道的人群患病率从1.1%到45%不等[1]，患者生活质量受到不同程度的影响，并造成巨大的医疗负担。IBS患者具有多种症候群，主要表现为反复发作的腹痛、腹部不适伴排便习惯改变，并有昼夜波动、时轻时重，以及与其他功能性胃肠病重叠或转换等节律紊乱特征[2-3]。既往研究发现肠-脑轴、内脏高敏感、肠道动力异常、黏膜屏障异常、肠道微生态改变、免疫紊乱等机制共同参与了IBS的发病，但上述理论均难以全面解释 IBS症状的节律紊乱特征。

哺乳动物的生物钟基因主要由正向调控因子Clock、Bmal1等与负向调控因子Per(period 1-3)、Cry(cryptochrome 1-2)等组成[4]。其中，Bmal1是最重要的生物钟正向调控转录因子，是参与生物钟正、负反馈通路的核心元件。在持续的黑暗环境中，Bmal1基因敲除小鼠表现为生物节律性完全消失[5]。肠道生物钟基因及其昼夜节律在功能性肠病发生中起有不可忽视的作用并逐渐得到研究者的关注[2-3,6-9]。目前，国内外鲜见有关结肠生物钟基因振荡在IBS症状昼夜波动中作用及其发生机制的研究报道。本研究通过检测腹泻型ISB(IBS with diarrhea, IBS-D)患者的结肠生物钟基因Bmal1表达以及5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)以及5-HT分泌细胞肠嗜铬细胞(enterochromaffin cells, EC细胞)的特异性标记物嗜铬粒蛋白A(chromo-granin A, CgA)表达，并评估患者的病情严重程度，旨在探讨结肠生物钟基因Bmal1在IBS-D症状发生中的作用及其可能机制，以期为IBS的临床诊治提供新思路。

对象与方法

一、研究对象

根据罗马Ⅳ标准[10]，于2018年9月—2021年2月从陆军特色医学中心消化内科门诊连续收集IBS-D患者。排除标准：①任何影响IBS-D的全身性疾病或消化系统器质性疾病，如消化道外肿瘤、消化道溃疡或肿瘤、胰腺炎、胆系疾病等；②消化道手术史；③神经内分泌相关疾病，如甲状腺功能亢进、糖尿病等；④因精神心理疾病无法完成问卷；⑤最近3个月服用过激素或免疫调节剂。结果共46例患者纳入研究，其中男性21例，女性25例，年龄20～65岁，平均(47.51±12.80)岁。同期招募健康志愿者34例作为正常对照组，其中男性16例，女性18例，年龄20～65岁，平均(45.60±12.74)岁。IBS-D组与正常对照组间性别构成、平均年龄差异均无统计学意义(P均>0.05)。研究方案经陆军特色医学中心伦理委员会审核批准，所有参与试验者均签署知情同意书，对样本采集知情同意。

二、方法

1. 样本采集：使用Olympus内镜系统(CLV-290SL)行结肠镜检查并取活检，活检部位统一为直肠乙状结肠交界处。取材时间点分别为上午9∶00(IBS-D组20例，正常对照组18例)和下午17∶00(IBS-D组26例，正常对照组16例)。

2. 病情严重程度评估：采用 IBS严重程度评分系统(IBS-severity scoring system, IBS-SSS[11])评估患者病情严重程度，由患者自评。该量表包括腹痛不适、每10 d中腹痛发作天数、当天腹胀不适程度、对大便情况的满意度和肠道症状对生活的干扰五个条目，每一条目评分0～100 分，总分为500 分，评分越高表明病情越重。

3. ELISA法检测结肠黏膜5-HT含量：制备结肠组织匀浆，离心、取上清液，参照ELISA试剂盒(Enzo Biochem Inc.)说明书进行操作，检测5-HT含量，检测时间点为上午9∶00。

4. 免疫荧光双标技术检测结肠黏膜CgA、Bmal1表达：结肠标本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，4 μm厚连续切片；脱蜡、微波抗原修复20 min，5% BSA封闭15 min；一抗孵育：兔源CgA一抗(1∶200, Abcam plc.)，鼠源Bmal1一抗(1∶200, Novus Biologicals)，湿盒中4 ℃孵育过夜；二抗孵育：Alexa Fluor 488标记(绿色荧光)羊抗兔IgG(1∶500, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)，CY3标记(红色荧光)羊抗小鼠IgG(1∶500,武汉爱博泰克生物科技有限公司)，加入二抗1 h后，湿盒中37 ℃孵育过夜；于样品上滴加适量免洗细胞核染料DAPI(蓝色荧光；碧云天生物)，1周内免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜拍照，ImageJ 6.0软件分析荧光强度。此外，每张CgA免疫荧光标记切片随机选取10个高倍视野(×400)，计数CgA阳性EC细胞数，结果取均值。

三、统计学分析

结 果

一、IBS-D患者结肠5-HT和EC细胞变化

ELISA法检测显示，IBS-D患者结肠黏膜中的5-HT含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义[(63.17±15.69) ng/mL对(25.52±7.80) ng/mL,P<0.001]；根据CgA免疫荧光计数EC细胞，IBS-D患者结肠EC细胞数量也较正常对照组明显增加，差异有统计学意义(2.57±0.91对1.28±0.70,P<0.05；图1)。

图1 IBS-D患者(A)和正常对照者(B)结肠黏膜CgA免疫荧光标记(×400)

二、IBS-D患者结肠Bmal1表达及其与IBS-SSS评分的相关性

免疫荧光和激光共聚焦技术检测显示，结肠生物钟基因Bmal1主要表达于肠上皮细胞。与同时间点取材的正常对照组相比，上午9∶00取材的IBS-D患者结肠Bmal1表达明显升高，下午17∶00取材的IBS-D患者结肠Bmal1表达明显降低，同时下午17∶00取材的IBS-D患者结肠Bmal1表达也较上午9∶00取材的IBS-D患者明显降低，差异均有统计学意义(P均<0.001；图2、图3)，提示IBS-D患者的Bmal1表达具有时间差异性，并与健康人存在显著差异。

A：IBS-D患者上午9∶00取材；B：正常对照者上午9∶00取材；C：正常对照者下午17∶00取材；D：IBS-D患者下午17∶00取材

两组间比较，***P<0.001

Spearman相关系数分析显示，上午9∶00取材的IBS-D患者结肠Bmal1表达与IBS-SSS总分和腹痛不适评分呈显著正相关(rs=0.413,P=0.023;rs=0.546,P=0.001)，与每10 d中腹痛发作天数、当天腹胀不适程度、对大便情况的满意度、肠道症状对生活的干扰四项评分均无相关性(rs=0.151,P=0.408;rs=0.269,P=0.137;rs=0.047,P=0.799;rs=0.201,P=0.269)。

三、EC细胞Bmal1与CgA共表达情况

采用连续切片免疫荧光双标技术将相邻的2张切片分别用于Bmal1和CgA染色，结果显示IBS-D患者的结肠生物钟基因Bmal1与EC细胞标记物CgA存在共表达，且在EC细胞中呈高表达(图4)。

A：EC细胞CgA表达(绿色荧光)；B：EC细胞Bmal1表达(红色荧光)；C：细胞核DAPI染色(蓝色荧光)；D：EC细胞Bmal1与CgA共表达；E：Bmal1、CgA与细胞核(DAPI)合并荧光图

讨 论

生物钟是生物体内一种无形的“时钟”，可使机体的行为、生理和新陈代谢的内部循环与外界环境周期性同步。昼夜节律是指生命活动以24 h左右为周期的节律性变化，机体的生理功能和行为活动与存在于分子、细胞、组织、器官和整体水平的昼夜节律密切相关[4]。对生物钟及其昼夜节律分子机制研究的重大突破性成果获得了2017年诺贝尔生理学或医学奖[12]。目前在哺乳动物小鼠体内已克隆鉴定出了十余种生物钟相关基因，分别为Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock(circadian locomotor cycle kaput)、Bmal1(Brain and muscle Arnt-like protein 1)、Timless、Npas2、Dec1-2、Rev-erba等。这些基因与其蛋白质产物构成自主调节转录和翻译反馈环，维持内源性生物钟运作，形成生物钟运转的正、负反馈机制[4,12]。昼夜节律由视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)中枢生物钟和与其关联的外周生物钟共同控制。外周生物钟在一定程度上独立于SCN，指导着一些特定的节律性生理活动[12]。对外周生物钟系统的探索是生物节律研究领域最新的深层次研究方向。肠道生物钟基因Bmal1如何参与IBS内脏敏感性昼夜节律紊乱的形成是一个重要的科学问题，深入探讨其相关机制对于IBS的治疗具有重要意义。

肠道生物钟基因及其昼夜节律在功能性肠病发生中的作用日益受到重视[2-3,6-9]。现有研究证实，轮班工作、跨时区飞行导致的昼夜节律紊乱可增加IBS的发生，诱导IBS样症状，与IBS的腹痛、腹泻、便秘等症状密切相关。Nojkov等[8]对399名护士的调查发现，轮班工作对IBS和腹痛患病率有显著影响，轮班护士的IBS患病率(48%)和腹痛患病率(81%)均显著高于日班护士(31%和54%)。有证据表明，生物钟及其昼夜节律紊乱可能通过影响肠-脑轴促使IBS发生[2-3,13]。本课题组前期研究表明：①在特定应激状态下，功能性胃肠病(包括功能性消化不良、IBS)患者存在生物钟节律紊乱，并与其焦虑、抑郁程度呈正相关[14]。②应激性IBS动物模型存在广泛的内脏敏感性改变，即痛觉敏化/去敏化现象[15]。 本研究通过免疫荧光双标技术检测发现，结肠生物钟基因Bmal1主要表达于肠上皮细胞，其与EC细胞标记物CgA存在共表达，且在EC细胞中呈高表达。此外，本研究还发现IBS-D患者的Bmal1表达具有时间差异性，并与健康人存在显著差异；其表达与患者的总体病情严重程度和腹痛不适症状呈显著正相关。上述发现为结肠生物钟基因及其昼夜节律参与IBS内脏敏感性昼夜节律紊乱的形成提供了有力证据。

已知EC细胞及其分泌的5-HT和5-HT合成限速酶色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase 1, TPH1)相关信号通路在IBS肠道动力异常和内脏高敏感的发生、发展过程中发挥非常关键的作用，是IBS发生最重要的病理生理学机制[16-17]。EC细胞是肠上皮细胞中一种重要的神经内分泌细胞，尽管其仅占肠上皮细胞数量的1%，但体内约90%的5-HT系由EC细胞分泌。5-HT通过激活肠黏膜上皮、黏膜下层或肌间神经丛的 5-HT 受体发挥重要作用。研究[17]显示炎症后IBS(PI-IBS)大鼠模型结肠EC 细胞计数、5-HT水平和TPH表达显著增高，同时内脏疼痛阈值明显降低；而槲皮素干预可显著降低结肠EC细胞密度、5-HT水平和TPH表达，并提高内脏疼痛阈值，槲皮素对 PI-IBS 的镇痛作用至少部分是通过抑制EC细胞的TPH-5-HT通路实现的。既往研究显示，中枢水平的5-HT受昼夜振荡节律调节[18]，同样，光照明暗变化可影响十二指肠的5-HT分泌[19]。由此推测，结肠生物钟基因可能通过调节5-HT分泌参与了IBS-D症状的发生。

机械敏感性离子通道蛋白基因Piezo2特异性表达于EC细胞。通过JASPAR数据库预测转录因子结合位点，发现Piezo2基因启动子区域存在由Bmal1基因调控的E-box元件(CACGTG)，提示其为Bmal1下游的钟控基因，Bmal1可能通过调节EC细胞的Piezo2基因转录，引起Piezo2依赖性的细胞内Ca2+增加，进而引发5-HT释放增多，参与IBS内脏高敏感的形成[20-21]。本研究结果表明，IBS-D患者存在结肠生物钟基因Bmal1表达紊乱、结肠EC细胞数量增多和5-HT分泌异常。结合既往文献报道和本研究结果，推测Bmal1可能通过与EC细胞上的Piezo2基因启动子区E-box元件结合调节其昼夜振荡以及Piezo2依赖性Ca2+内流，进而引发5-HT分泌的昼夜振荡，最终导致IBS-D症状发生，但该过程涉及的具体分子机制有待进一步研究。从生物钟紊乱角度认识IBS的发生机制，为临床探讨难治性或昼夜节律紊乱相关IBS的治疗奠定了理论基础。