胚胎培养液用于染色体筛查的初步研究

韩瑞钰 王雪莹 邓佩佩 和 伟 姚冠峰 郭 薇

河北省计划生育科学技术研究院，国家卫计委计划生育与优生重点实验室(石家庄，050071)

胚胎染色体异常是反复着床失败以及自然流产的重要原因之一，其中20%～80%的人类胚胎是染色体非整倍体[1]。通过体外受精—胚胎移植(IVF-ET)方法获得的胚胎有40%～60%存在染色体异常，筛选染色体正常胚胎进行移植，可以提高临床妊娠率。胚胎植入前遗传学检查(PGT-A)目前已广泛应用于IVF的胚胎筛选，很多临床实验已证明PGT-A的临床有效性[2-3]，但PGT-A的安全性备受争议，卵裂期活检会降低胚胎质量，探索无创胚胎染色体筛查(NICS)技术尤为重要。目前人类胚胎已被证明可以释放DNA片段进入外部培养环境，从囊胚腔液和废弃培养基中可以提取DNA，为无创胚胎染色体筛查技术提供了关键信息。已有很多研究表明利用胚胎培养液中游离DNA对胚胎染色体进行筛选的有效性[4-6]。本研究采集胚胎培养液进行胚胎染色体检查，观察胚胎培养液用于胚胎染色体筛查的检出成功率及准确率，为无创胚胎染色体筛查技术的研究及应用提供证据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

经患者同意后采集河北省生殖医学中心接受辅助生殖技术受孕者的废弃囊胚及培养液，胚胎培养液标本86例、囊胚36枚；其中56例为卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)的胚胎培养液，30例为IVF-ET的胚胎培养液。

1.2 采集方法

经患者同意后收集胚胎培养3～5d的培养液，为防止介质交叉污染，每个胚胎使用不同的巴斯德吸管。前期胚胎培养时培养液加入量为20～25μl，改进方法后胚胎培养的培养液加入量10～15μl，相对提高了培养液中游离DNA的浓度。将来自每个胚胎的胚胎培养液转移到含有5μl细胞裂解缓冲液的无RNase-DNase的PCR管中，-20℃保存。空白培养基与囊胚同条件培养，同样方式收集保存。收集36例培养液对应的囊胚放入含有5μl细胞裂解缓冲液的无RNase-DNase的PCR管中，-20℃保存。

1.3 胚胎培养液游离DNA(NICS)及囊胚(PGS)染色体检测

采用基因测序通用文库试剂盒ChromInstTM对囊胚进行MALBAC单细胞全基因组扩增及文库构建；采用基因测序通用文库试剂盒NICSinstTM对胚胎培养液游离DNA进行MALBAC单细胞全基因组扩增及文库构建，构建文库在Ion Chef进行样本的全自动处理，最终在Ion GenestudioTMS5高通量测序平台进行测序，运用ChromGoTM2.0数据分析平台检测染色体非整倍体及>10M片段缺失和(或)重复。

1.4 统计学分析

计算胚胎培养液染色体检出率，运用χ2检验比较改进方法前后培养液染色体检出率的差异；两种受精方式收集的培养液检测结果一致性及假阳性、假阴性的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NICS染色体检出情况

86例胚胎培养液中27例未检出染色体核型，方法改进后收集的标本与前期相比，检出成功率明显提高(P<0.05)。见表1。

表1 方法改进前后NICS染色体检出情况比较

2.2 PGS与NICS检测结果对比

对36例囊胚与其培养液的检测结果进行对比，IVF-ET培养液和其胚胎共计18例，7例染色体倍性一致，一致率38.9%(7/18)，培养液共检测出非整倍体15例，9例假阳性性结果，假阳性率50%，假阴性率0%，2例样本虽然均为整倍体结果，但是与对应囊胚结果性别不一致，考虑颗粒细胞污染，故不计入分析结果。ICSI-ET培养液及其胚胎共计18例，14例染色体倍性一致，一致率77.8%(14/18)， 培养液共检测出非整倍体10例，3例假阳性结果，假阳性率16.7%，1例假阴性结果，假阴性率5.6%。两种受精方式培养液检出的染色体倍性一致率(χ2=5.6，P<0.05)、非整倍体的假阳性率有统计学差异(χ2=4.5，P<0.05)，非整倍体的假阴性率无统计学差异(P>0.05)。

3 讨论

自MALBAC单细胞全基因组扩增技术发现以后，胚胎培养游离DNA检测获得很大突破，使NICS技术成为可能。Xu等[4]对42例囊胚检测显示囊胚培养基与对应胚胎染色体异常结果高度一致，灵敏度达0.882，特异性达0.840。Huang等[7]对无创植入前非整倍体检测(niPGT)与滋养外胚层(TE)活检结果进行对比，灵敏度达100%，特异性为80%，胚胎倍性和染色体拷贝数一致性均高于TE活检。在NICS临床应用有效性上，Rui等[5]运用NICS技术筛选出52枚整倍体胚胎进行移植，临床妊娠率达58%，27个出生孩子染色体均正常，证明NICS可以在一定程度上反映胚胎染色体情况。

本研究中前期收集胚胎培养液中染色体检出率仅有41.7%，经过对胚胎培养时培养液加入量进行调整，增加了培养液中游离DNA的浓度，后期样本扩增率高达88.0%。说明胚胎培养液体积对检测结果有很大影响，目前较多研究均对胚胎培养液与囊胚染色体检测结果染色体倍体一致率进行了对比研究，Xu等[8]的研究中胚胎培养液与整胚染色体检测结果染色体倍体一致率达87.7%；Liu等[9]的研究中胚胎培养液与胚胎卵裂球活检检测结果染色体倍体一致率达64.5%；Li等[10]的研究中胚胎培养液与整胚染色体检测结果染色体倍体一致率50.0%。本研究显示ICSI-ET和IVF-ET两种方式培养染色体倍体一致率分别为77.8%和38.9%，可能与这两种体外受精方式也有一定的关系。，胚胎培养液中游离DNA来源于胚胎发育过程中凋亡细胞，由于含量极微，检测过程中很可能会受到污染，比如卵丘细胞的污染，以及未消除精子的污染，这要求在胚胎受精过程中必须采用一些措施避免污染。胚胎培养液游离DNA检测另外一个难点是DNA含量太低导致扩增失败或者染色体嵌合增多而出现假阳性的结果，这就要求对培养的阶段和时间进行摸索，这一过程仍然需要大量样本的测试和收集。

本研究结果显示ICSI-ET培养倍体一致率明显高于IVF-ET，说明ICSI-ET方式培养的胚胎培养液用于游离DNA检测优于IVF-ET；IVF-ET培养液检测假阳性率高达50%，可能是受精方式导致培养液受精子及卵丘细胞的污染可能性较高。因此，认为ICSI-ET胚胎培养液更适用于胚胎染色体筛查。目前少见ICSI-ET和IVF-ET 培养液检测胚胎染色体倍体一致率对比文章。

综上所述，收集的胚胎培养液用于胚胎染色体检测ICSI-ET优于IVF-ET，对培养液量进行调整，增加游离DNA浓度明显提高了扩增成功率。之后研究中应该更加关注增加培养液中游离DNA的浓度、消除卵丘细胞污染等方面，建立更加完善的培养流程，保证培养液用于胚胎染色体检测结果的稳定性和准确性。