无精子症患者基因检测分析

邓佩佩 马 婧 张展羽 张文昊 宋潇潇 刘 杰 张香改 韩瑞钰

河北省计划生育科学技术研究院，国家卫健委计划生育与优生重点实验室(石家庄，050071)

有研究显示近15%的不育男性为无精子症患者，包括梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症[1-2]。据估计，至少50%的无精子症是由遗传缺陷引起的，包括染色体数目畸变、囊性纤维化跨膜转导因子(CFTR)基因突变和Yq11染色体上的无精子因子(AZF)区域的微缺失。但是仍有很大一部分无精子症患者未找到明确致病原因。男性不育是一个复杂的病理变化，涉及很多基因，目前已知的人类睾丸富集基因有2300个[3]，这些基因中任何一种的基因的变异都会影响到男性生育，且这些突变在人群中都将始终保持非常低的频率。随着测序技术的发展，对大量基因进行筛选已成为可能，目前已有研究利用全外显子测序筛选新的变异基因[4-5]。本文针对无精子症患者进行全外显子测序，目的是筛选精子发生障碍相关基因，丰富男性不育基因库。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取20例在本中心就诊的男性无精子症患者，排除标准： 由化疗或放疗、创伤性或感染性睾丸炎、精索静脉曲张、双侧隐睾等原因导致的无精子症; 由勃起功能障碍/性欲丧失/无性高潮、逆行射精/无射精、先天性输精管缺失、输精管切除术、外伤或感染引起的机械性梗阻等原因导致的；染色体及AZF结果异常；梗阻性无精子症。

1.2 激素检测

空腹8～12h，抽取清晨静脉血置促凝管，室温静置1h后离心取血清备用。采用化学发光免疫分析方法测定血清促卵泡生成素(FSH) 、促黄体生成素(LH) 、睾酮(T) 、雌二醇(E2) 、泌乳素(PRL)。

1.3 全外显子测序及位点验证

提取研究对象外周血DNA，经片段化、连接接头、扩增纯化后，使用杂交捕获方法构建DNA文库，采用高通量测序技术检测人类全外显子组中20099个基因的外显子区及旁侧内含子区(20bp)，将测序数据与人类基因组hg19参考序列进行比对，并对目标区域的覆盖度及测序质量进行评估。对变异位点进行筛选，筛选与精子生成障碍相关的基因，运用PolyPhen2、SIFT、Mutation_Taster软件预测蛋白功能。根据ACMG指南对变异位点进行评估。筛选出来的变异位点，通过PCR技术扩增相关基因外显子及旁侧内含子区域，进行Sanger测序验证。

2 结果

2.1 一般资料

20例无精子症患者，年龄25～45岁，经染色体核型分析和Y染色体微缺失检测(AZF)未发现异常，激素检测结果除1例(13号)患者外，其余均激素水平异常。详细信息见表1。

表1 20例无精子症患者相关信息

2.2 基因变异位点筛选

通过筛选共计选出26个基因43个变异位点，排除15个常染色体隐性遗传的单个变异位点及13个与精子运动相关的变异位点，剩余11个基因的15个变异位点可能与精子发生障碍相关。对这15个变异位点均进行Sanger测序验证，其中包括FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5个基因在睾丸组织高表达，SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6个基因可能与精子发生障碍相关，见表2及图1(封三)。

表2 11个基因变异位点信息

3 讨论

男性不育发病较复杂，涉及基因很多，与其他单基因疾病不同，该疾病发病基因突变均较罕见，需要大量标本大量基因筛选候选基因。目前随着测序技术的发展，检测费用的降低，已有很多基因被证明可能与男性不育相关，本文对20例无精子症患者进行全外显子测序筛选，检测到可能会影响男性精子生成或发生障碍的26个基因43个位点变异。排除其中15个常染色体隐性遗传的单个变异位点；13个与精子运动相关的变异位点(对象为无精症患者)， 剩余15个变异位点可能与精子发生障碍相关。15个变异位点涉及11个基因，其中包括5个基因(8个变异位点)数据库中显示在睾丸组织中高表达，6个基因(7个变异位点)可能与精子生成障碍相关。

FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP这5个基因数据库信息显示其在睾丸组织表达较高。

FAM71B基因编码的蛋白可能参与RNA生物反应，该基因在睾丸中表达较高，在其他组织中表达均很低，但其具体作用未查到相关报道研究。本研究中12号患者该基因发现2个变异位点c.1339C>T，c.197G>A，生物信息学软件PolyPhen2、SIFT、Mutation_Taster预测有害，但Mutation_Taster对c.197G>A预测为良性，2个变异位点在人群中的频率均较低，但是这2个位点变异未见报道，因此其临床意义未明。

STARD9基因编码有丝分裂过程中的纺锤体极组装所需的微管依赖性的马达蛋白，影响纺锤体极组装，该基因在睾丸中表达较高但不是特异性表达，但是目前研究认为该基因是癌症治疗的重要的靶点[6-7]。本研究在11号患者中发现该基因2个变异c.1346A>C和c.12764G>A，在人群中频率较低，也未见相关报道，其在无精子症中的作用有待进一步研究。

CLTCL1基因编码小网格蛋白重链(CHC22)在肌肉-骨骼中表达最高，其次是睾丸。Vassilopoulos等[8]发现CHC22在人类肌肉和脂肪细胞中形成胰岛素反应性GLUT4区隔的过程中发挥了作用,认为chc22依赖的膜转运在人类肌肉和脂肪中构成了一种物种限制的通路，对2型糖尿病具有潜在的影响。Nahorski等[9]研究认为CLTCL1在神经嵴发育以及痛觉和触觉感觉神经元的形成过程中起着重要的作用。对于该基因对精子生成的影响尚未见报道。在本研究中发现17号患者该基因发生c.3545G>A、c.1331G>A杂合变异，在正常人群中频率较低。生物信息学软件PolyPhen2、 SIFT、 Mutation_Taster预测有害，但PolyPhen2对c.3545G>A预测为良性。因此，CLTCL1基因对男性不育的影响有待进一步验证研究。

PCBP3基因编码的蛋白是KH结构域蛋白亚家族成员，在转录后活性中起重要作用，在睾丸中表达较高。15号患者中检出的c.1079+2T>C杂合变异未见报道，在正常人群中未检出，临床意义未明，目前对该基因研究报道较少。

S100PBP编码的功能目前尚不清楚，其是通过与S100钙结合蛋白P的相互作用而鉴定出来的蛋白质，在睾丸中表达丰度很高。16号患者发现c.1221_1222delCA杂合变异，在正常人群中未找到，临床意义未明。

SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6个基因的变异可能与精子生成障碍相关。

SYCE3基因属于联会复合体中心元件蛋白，可能作为重要元件启动同源染色体形成联会复合体的过程，该基因可能与细胞分裂、同源染色体重组、精子生成等密切相关，在睾丸中表达很高，在其他组织中表达很低。 Schramm等[10]克隆了小鼠Syce3， RT-PCR分析12个小鼠组织，仅在睾丸和胚胎卵巢中检测到Syce3。本研究发现1号患者c.181_184delCGGC纯合变异，在正常人群中未检出，该变异会导致氨基酸编码异常，终止密码子丢失，蛋白多肽链翻译延长，对蛋白功能影响未知。但是该变异未有临床报道，Schramm等[10]发现敲除小鼠SYCE3基因可导致小鼠不育。因此SYCE3基因很可能会影响男性的生育能力，导致不育，由于患者不愿意继续检测，其临床意义未确定，有待进一步研究。

EFCAB6该基因编码是一种直接结合癌基因DJ-1和雄激素受体的蛋白，在细胞中形成三元复合体。这种结合蛋白招募组织去乙酰化酶复合物，以抑制雄激素受体的转录活性，也可能在精子形成和受精过程中发挥作用，在睾丸中特异表达很高，其他组织中表达较低。9号患者发现c.1576C>T、c.677C>A两个杂合变异，在正常人群中频率较低。临床意义未明，目前对该基因研究报道很少。

DDX4基因编码的蛋白是一种推测的RNA解旋酶，它们参与了许多涉及RNA二级结构改变的细胞过程，如翻译起始、核和线粒体剪接、核糖体和剪接体组装。该基因在生殖细胞谱系中具有特异性表达，在生殖细胞发育过程中起着重要作用。 Chu等[11]采用蛋白质组学、细胞学和功能分析相结合的方法对秀丽隐杆线虫进行分析研究寻找生殖相关蛋白，在与线虫蛋白相对应的小鼠基因敲除中，37%导致雄性不育，其中就包括了DDX4基因。本研究中13号患者发现在该基因存在c.204_205delAG的缺失突变，在正常人群中未见收录。该变异导致氨基酸框移突变，导致蛋白合成提前终止，因此其对男性不育的影响有待进一步研究。

KDM5D基因编码的蛋白是赖氨酸特异性去甲基化酶5D。该蛋白是一种组蛋白去甲基化酶，可以特异性的使组蛋白H3的“Lys-4”去甲极化，可能与精子发生有关，但是未见相关报道研究。15号患者发生c.3035G>C的半合子突变，在正常人群中未见收录，临床意义未明。

RGS22基因编码的蛋白是G蛋白信号调节因子22，可通过增加G蛋白α亚基的GTP酶活性抑制信号转导。 Hu等[12]研究显示无精子症患者睾丸中RGS22表达明显降低，RGS22在梗阻性无精子症中表达正常。患者16号检测到c.2966_2967delTA杂合变异，正常人群中未检出,该变异可导致蛋白合成提前终止，因此该基因对男性生育的影响值得进一步研究。

MTL5基因金属硫蛋白是一种高度保守的低分子量半胱氨酸蛋白，可能在细胞生长和分化的调控中发挥核心作用，并参与精子的形成。该基因编码一种金属硫蛋白样蛋白，在小鼠睾丸和卵巢中表达不同。Sugihara等[13]通过对小鼠组织mRNA进行随机RT-PCR，分离出睾丸特异性转录本，称之为TF1。通过以TF1为探针筛选人类睾丸cDNA文库， 克隆了一种新的称之为睾丸特异性金属硫蛋白样蛋白(tesmin) 的cDNA ，Tesmin编码一种预测的富含半胱氨酸、295个氨基酸的蛋白质，与小鼠Tesmin同源性为76.3%，序列分析显示存在2种金属硫蛋白(MT)样基序。MT在睾丸中的表达高于肝脏组织[14]，在小鼠雄性生殖细胞中以发育调控的方式活跃表达。8号患者发生c.197C>G纯合变异，正常人群中频率较低，未见报道。

生殖激素异常是男性不育的一个重要因素，多数研究都显示无精子患者生殖激素出现异常，且与染色体变异有很大关系[15-16]。本研究为探讨激素水平是否与基因突变存在关联，对患者进行了激素检测，除1例患者激素水平正常外其余均表现为生殖激素水平的异常，因本研究纳入病例较少，因此生殖激素异常与基因变异之间关系有待探讨。

综上所述，在本研究中检测到的FAM71B、STARD9、CLTCL1、PCBP3、S100PBP等5个基因发现在睾丸中表达较高，但是无动物实验证明及相关临床报道，这5个基因对于男性生育的影响需要进一步研究。本研究中检测的SYCE3、EFCAB6、DDX4、KDM5D、RGS22、MTL5等6个基因的变异可能与精子生成障碍相关，其中SYCE3、DDX4、RGS22 基因均有研究表明在生殖中发挥重要作用，影响精子的生成，但这些基因的变异目前未见临床报道。本研究筛选到11个可能影响男性生育的基因，为男性不育基因诊断研究提供参考，但是都未能得到进一步证实，本研究会继续深入研究这些基因对男性不育的影响，为男性不育的基因诊断提供有力证据，丰富男性不育的基因库。