猪FNDC5 基因生物信息学分析及表达研究

黑 伟，何志强，张燕伟，张万锋，蔡春波，杨 阳，高鹏飞，郭晓红，曹果清，李步高

(山西农业大学动物科学学院，山西 太谷 030801)

2002 年，纤连蛋白Ⅲ型重复含蛋白(Fibronectin type Ⅲ Repeat Containing Protein，FRCP2) 被发现，它包含信号肽、纤维蛋白结构域和疏水性C 末端结构域，可以水解形成具有分泌功能的蛋白质鸢尾素(Irisin)[1-2]。在小鼠上，抗纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白5(Fibronectin Type III Domain Containing Protein5，FNDC5) 基因定位在四号染色体上，包含6 个外显子，翻译209 个氨基酸残基，信号肽为第1 个至第30 个氨基酸残基，纤维蛋白结构域为第31 个至第114 个氨基酸残基，疏水性C 末端结构域为第115 个至第172 个氨基酸残基。Irisin 包含112 个氨基酸残基，分子量约为12 kDa。生物化学和X 射线晶体学研究都表明，Irisin 以同二聚体的形式存在，在同二聚体之间形成β-折叠。这种结构通过氢键与相邻亚单位(特别是Arg-75 和Glu-79) 之间相互作用，保护二聚体末端[3]。

Varela 等报道，FNDC5 在骨骼肌中高表达，在心血管、脂肪和肝组织中也有少量表达[4]。Irisin 通过p38 MAPK 和ERK MAPK 通路可促进脂肪组织UCP-1、PGC-1α、Cox7α、Ebf3等产热特异性基因的表达，引起白色脂肪棕色化，增加机体能量消耗[5]。FNDC5 可以增加高脂饮食小鼠的能量消耗，从而使小鼠体重减轻，并且能提高胰岛素的敏感性[6]。大鼠静脉注射Irisin，通过AMPK 信号通路可改善自发性高血压大鼠内皮功能障碍，进而降低其血压[7]。Irisin 通过抑制小鼠CD36、NF-κB 的表达可减缓动脉粥样硬化的发生，还可以使动脉粥样硬化斑块内浸润的巨噬细胞和T 淋巴细胞以及主动脉炎性细胞因子的表达量降低，进而减缓病情发展[8]。

目前国内外关于FNDC5 基因的研究大多都是针对人和小鼠上的FNDC5 基因，对猪FNDC5 基因的研究报道较少。本研究利用RTPCR 扩增猪FNDC5 基因的编码序列(Coding Sequence，CDS)，运用软件对FNDC5 基因进行生物信息学分析，利用qRT-PCR 检测FNDC5基因在晋汾白猪各组织中的表达量，为以后研究猪FNDC5 基因的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集

选取3 头1 日龄晋汾白猪，屠宰后取其背最长肌、肾、肝、心、胃、肺、皮下脂肪和脾等组织，迅速放入液氮罐中，之后于－80 ℃冰箱中保存备用。

1.1.2 主要试剂

2×ES Tap MasterMix 购自CWBIO 公司；TRIZOL® Reagent 购 自Life Technologies公司；DH5α 感受态细胞、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、反转录和实时荧光定量试剂盒购自TaKaRa 公司；氯仿、异丙醇和乙醇等均为分析纯。

1.2 引物设计和合成

在NCBI 数据库中查找猪FNDC5 mRNA 序列，运用 Primer Premier 5.0 设计普通PCR 引物以及qRT-PCR 引物，选取18S rRNA 为内参基因，引物由上海生工生物工程公司合成，引物信息见表1。

1.3 总RNA 提取和cDNA 合成

按照Trizol® Reagent 试剂盒说明书提取晋汾白猪各组织的总RNA，测定纯度和浓度后反转录合成cDNA。cDNA 合成采用两步法，20 μL 体系，第1 步：RNA 800 ng，加去除基因组DNA 反应试剂至10 μL，混匀后42 ℃反应2 min；第2 步：在上述混合液中加入反转录试剂10 μL，总体系为20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。得到的cDNA 于－20 ℃保存备用。

1.4 FNDC5 基因CDS 序列扩增

以晋汾白猪背最长肌cDNA 为模板扩增猪FNDC5 基因的CDS 序列，PCR 反应体系为：2×ES Tap MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H2O 6 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预加热4 min；94 ℃变性30 s；61 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s；共40 个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。产物经琼脂糖凝胶检测后进行胶回收。将回收纯化的产物与pMD18-T 载体于16 ℃下过夜连接。得到的产物转化到DH5α 感受态细胞中，涂板挑菌，菌液经PCR 鉴定后送华大基因公司测序。

1.5 生物信息学分析

利用NCBI 网站的ORF Finder 预测FNDC5基因的开放阅读框；利用在线软件 ProtParam对FNDC5 基因的编码蛋白进行理化特性分析；利用ProtScale 软件分析猪FNDC5 的疏水性图谱；利用在线软件PSORT 域预测FNDC5的亚细胞定位；运用SOPMA 在线软件对FNDC5 的二级结构进行预测；利用SWISSMODEL 软件分析FNDC5 三级结构。

1.6 晋汾白猪各组织FNDC5 基因的表达水平分析

以1 日龄晋汾白猪各组织cDNA 为模板，18S rRNA 为内参基因，采用qRT-PCR 检测FNDC5 基因的表达量。反应体系如下：上下游引物各0.3 μL，TB Green Premix Ex TaqⅡ(2×)5 μL，cDNA 1 μL，RNase-free H2O 3.4 μL。反应程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，40 个循环；95 ℃ 30 s，60 ℃1 min；95 ℃ 30 s。每个样本设3 个重复，基因的相对表达量用2-ΔΔCt方法分析。

1.7 数据分析

所有数据使用SPSS 22.0 软件中的单因素方差分析进行差异显著性检验，结果采用Duncan's 法进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 FNDC5 基因CDS 序列扩增

以晋汾白猪背最长肌cDNA 为模板克隆FNDC5 基因的CDS 序列，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到的目的条带与预期条带大小相符(图1)。胶回收后与pMD18-T 载体连接，经菌液PCR 筛选后送去测序，测序结果与NCBI 中猪FNDC5 基因CDS 序列完全匹配。

2.2 FNDC5 基因序列的生物信息学分析

2.2.1FNDC5 基因开放阅读框预测

运用NCBI 中的ORF Finder 程序进行分析，FNDC5 基因的开放阅读框位于1 bp～843 bp，编码280 个氨基酸(图2)。

2.2.2 FNDC5 的理化特性分析

利用在线软件 ProtParam 对FNDC5 基因的编码蛋白进行理化特性分析，结果表明，FNDC5 的分子式为C1382H2223N385O401S17，总原子数为4 408 个，分子量为31.19 ku，理论等电点(PI)为8.55。FNDC5 共包含20 种氨基酸，含量最高的为亮氨酸(10.4%)，最少的为组氨酸和酪氨酸，所占比例都为1.4%(表2)。带正电氨基酸残基(精氨酸和赖氨酸)33 个，带负电氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)29 个。平均亲水性系数是－0.069，不稳定系数为58.43。该蛋白半衰期为30 h，脂肪系数为94。

图2 猪FNDC5 基因开放阅读框预测

2.2.3 FNDC5 疏水性分析及亚细胞定位

利用ProtScale 软件分析猪FNDC5 的疏水性图谱(图3)。FNDC5 第152 位氨基酸的疏水性分值最高，为4.022，疏水性最强，第177 位和第199 位氨基酸的分值最低，为－3.078，亲水性最强。FNDC5 共编码280 个氨基酸，其中145 个氨基酸的分值小于0，135 个氨基酸的分值大于0，亲水性氨基酸比疏水性氨基酸多，但均匀分布在整个肽链中。

利用在线软件PSORT 域预测FNDC5 的亚细胞定位，结果表明，FNDC5 主要位于细胞质中，44.4%位于内质网，33.3%位于高尔基体，22.2%位于细胞质膜。

2.2.4 FNDC5 高级结构预测

运用SOPMA 在线软件对FNDC5 的二级结构进行预测，结果表明，α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占31.79%、4.64%、20.36 % 和43.21 % (图4)。利 用SWISSMODEL 软件分析FNDC5 的三级结构，结果显示，FNDC5 含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲等复杂结构(图5)。

图5 猪FNDC5 三级结构预测

2.2.5FDNC5 基因在各组织的表达特性分析

利用qRT-PCR 检测FNDC5 基因在晋汾白猪8 种组织(背最长肌、肾、肝、心、胃、肺、皮下脂肪和脾)中的表达量。由图6 可知，在所检测的8 种组织中，FNDC5 基因均有表达，但存在较大差异。FNDC5 基因在肌肉、肝脏和心脏中高表达，在其他组织中的表达量较少。

3 讨论

FNDC5 基因在调控细胞增殖、分化、能量代谢和血管生成方面有重要作用。目前，FNDC5 基因在人类心血管疾病方面以及在小鼠肌肉与脂肪等组织上的研究较多[9-11]，在猪上的报道较少。本试验运用PCR 扩增得到晋汾白猪FNDC5 基因的CDS 序列，利用生物信息学软件进行生物信息学分析，采用qRT-PCR 检测FNDC5 基因在晋汾白猪各组织中的表达情况。

骨骼肌是能量代谢最旺盛的器官，参与机体各种生命活动。过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅激活因子1α(Peroxisome Proliferatoractivated Receptor Gamma Coactivator 1α，PGC1α)是一种参与基因表达调控的因子，在维持葡萄糖、脂质和能量稳态方面起着关键作用。PGC1α 通过运动在骨骼肌中被诱导，并具有刺激运动的有益作用[12]。Bostrom 等[6]在小鼠骨骼肌中发现，当PGC 1α 水平升高时会上调Irisin 表达，在其分泌到血液时会促进UCP1的表达，并诱导白色脂肪细胞向米色脂肪细胞转化，增加机体总能量的消耗。有报道显示，耐力训练可提高快肌中Irisin 蛋白水平，降低慢肌中Irisin 蛋白水平[13]。FNDC5 基因在猪上的功能及其调控机制还需进一步探讨。