实时荧光PCR 检测腹泻患者肠致泻性大肠杆菌的分布情况研究

刘蕴博

大肠埃希氏菌,通常又将其称为大肠杆菌,是人类动物肠道中普遍存在的正常菌群,但是部分血清型大肠杆菌也可导致腹泻发生。根据其临床特点、发病机制以及流血病学等特征,可将致泻性大肠杆菌分为肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠黏附性大肠杆菌等五种类型［1］。其中肠致病性大肠杆菌可导致婴幼儿或5 岁以下儿童发生腹泻；肠出血性大肠杆菌具有普遍易感性,尤其多发于老年人和儿童；肠产毒性大肠杆菌不论是对成人,还是对小孩,均可导致其发病；肠侵袭性大肠杆菌可导致成人或大龄儿童出现菌痢样腹泻,肠黏附性大肠杆菌与小儿顽固性腹泻具有较大关系［2］。为了解肠致泻性大肠杆菌在腹泻患者中的分布情况,本文应用实时荧光PCR 检测技术对其展开了如下研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年10～12 月期间检查的150 例腹泻患者粪便标本为研究对象,其中男82 例,女68 例。所使用仪器包括实时荧光PCR 仪、高速离心机、恒温培养箱；培养基使用GN 增菌液,检测试剂包括肠产毒性大肠杆菌、肠黏附性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌实时荧光诊断试剂盒。

1.2 方法 采集粪便标本后,首先使用GN 增菌液对其进行增菌处理,然后采集增菌液1 ml,以13000 r/min的速度对其进行离心处理,离心2 min 后去掉上清,将100 μl 的DNA 提取液充分混匀后,置于沸水中对其进行水浴,10 min 后再次以13000 r/min 的速度离心5 min,采集上清液作为实时荧光PCR 反应的模板DNA,然后应用实时荧光PCR 反应体系和扩增程序对其进行相应操作。

2 结果

2.1 检出情况分析 150 例腹泻粪便样本中,共检出致泻性大肠杆菌36 例,总检出率为24.00%(36/150)。其中检出肠致病性大肠杆菌18 例,占比50.00%,肠黏附性大肠杆菌12 例,占比33.33%；肠出血性大肠杆菌3 例,占比8.33%；肠产毒性大肠杆菌2 例,占比5.56%,肠侵袭性大肠杆菌1 例,占比2.78%。见表1。

表1 36 例致泻性大肠杆菌分布情况分析(n,%)

2.2 患者不同时间及年龄段的病原菌检出情况分析10 月致泻性大肠杆菌的检出率为25.93%,11 月和12 月致泻性大肠杆菌检出率分别为26.00%和19.57%,以11 月检出率较高。从年龄分布情况来看,<5 岁患者的致泻性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌检出率相对较高。见表2。

表2 150 例患者不同时间及年龄段的病原菌检出情况分析［n(%)］

3 讨论

腹泻是一种临床常见疾病,在各类细菌性传染病中,感染性腹泻所占比重较大,可对患者生活质量造成较大影响［3］。有研究学者采用传统分离培养及分子生物学检测技术对致泻性大肠杆菌的分布情况进行调查研究发现,我国致泻性大肠杆菌主要有五种较为常见的类型,其中肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌均较为常见［4］。

本研究结果显示,150 例腹泻粪便样本中共检出致泻性大肠杆菌36 例,总检出率为24.00%,其中检出肠致病性大肠杆菌占比50.00%,肠黏附性大肠杆菌占比33.33%；肠出血性大肠杆菌占比8.33%；肠产毒性大肠杆菌占比5.56%,肠侵袭性大肠杆菌占比2.78%。腹泻患者的致泻性大肠杆菌以肠致病性大肠杆菌、肠黏附性大肠杆菌为主。据资料报道,80 年代在各类肠致泻性大肠杆菌中,以肠产毒性大肠杆菌为主,其次为肠致病性大肠杆菌［5-8］,由此可见,我国的致泻性大肠杆菌分布情况已经发生了较大改变。通过对本研究所选病例的不同时间的分布情况来看,11 月份的致泻性大肠杆菌检出率相对较高,体现了细菌性腹泻多发于夏秋季的流行病原学特性。<5 岁患者的致泻性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌检出率相对较高,说明该类病原菌是导致儿童腹泻的重要原因,与相关文献报道一致［9］。肠黏附性大肠杆菌与小儿顽固性腹泻具有较大关系,目前对于该类病原菌主要采用分子生物学手段进行鉴定［10］,本研究运用实时荧光PCR 技术对其进行检测,敏感性高于传统的分离培养技术,但各相关致泻性大肠杆菌的检出率仍然较高,分析其原因可能在于：①卫生环境改善和生活水平的提高,极大地改善患者生活条件,可降低患者的腹泻病发病率；②本研究所选样本量较少,且所选取的时间段较窄,无法较为全面的反应腹泻患者的病原菌分布情况,且所采集数据无法反映全年情况［11］；③粪便标本采集是否规范、标本保存及送检条件,是否在服用抗生素前采样等,都可能影响检出结果的可靠性。

总而言之,实时荧光PCR 是目前病原菌诊断较普及的分子生物学技术,具有耗时短和操作简单等优势,且在敏感性和特异性方面明显优于常规PCR,是当前诊断腹泻患者各种病原菌分布的首选方法。在病原菌数量处于常规分离培养的检出限以下时,利用分子诊断方法能够获得较为准确地检测结果,但随着实时荧光PCR 技术的推广,该技术在致泻性大肠杆菌就其他病原菌检测中发生了极为重要的作用,可进一步推广应用该方法。