TLR4 在高血压基底节区脑出血患者破裂动脉的表达研究

姚庆和 黄建围 曹东彪 陶山伟

脑血管疾病是严重危害人类健康的一类疾病,死亡率约占所有疾病的10%,50%～70%的存活者遗留有肢体瘫痪、失语、智力障碍等严重残疾。脑出血约占全部脑卒中的8%～14%,死亡率高,存活患者也往往遗留严重的神经功能障碍。脑出血最常见的是长期高血压导致的基底节区脑动脉破裂出血,脑细小动脉的硬化在发病机制中占有重要地位,但脑动脉硬化的病理机制尚不十分清楚,目前发现伴有免疫反应的慢性炎症过程在动脉硬化的发生发展过程中起着决定性作用。本研究通过手术中切取高血压基底节区脑出血患者已破裂动脉止血后的残端,检查Toll 样受体(Toll-like receptors,TLR)家族中TLR4 在高血压基底节区脑出血患者破裂动脉的表达,探讨TLR4 在促进脑动脉硬化形成的作用,为脑出血的防治提供新的思路。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2017 年1 月～2019 年4 月收治的20例高血压基底节区脑出血患者,其中男13例,女7 例；年龄42～68 岁,中位年龄55.4 岁；高血压病史1～19 年,平均高血压病史7.8 年；发病至入院时间1～6 h,平均发病至入院时间2.3 h；均经头颅CT 扫描检查确诊为基底节区脑出血；出血量44～86 ml,平均出血量61.6 ml；格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分：8～12 分7 例,3～8 分13 例,平均GCS 评分6.6 分。

1.2 方法

1.2.1 手术方法 采用全身麻醉,额颞部弧形切口,游离骨瓣开颅,手术显微镜下由颞上回皮层造瘘进入血肿腔,缓慢吸除血肿,在基底节区血肿底部寻找破裂动脉,在破裂口近端数毫米处双极电凝止血,切除止血后的残端部分约2～3 mm。同时在额颞部头皮弧形切口已切断颞浅动脉的分支切取2～3 mm 后止血,不影响头皮切口愈合(切除高血压基底节区脑出血已破裂动脉止血后的血管残端,头皮切口中已切断的颞浅动脉分支2～3 mm,而并非切取患者的正常脑动脉和头皮动脉,因此对患者治疗和预后无任何不利影响,此研究已经通过医院伦理委员会审查并获批准)。切取标本甲醛固定,石蜡包埋。术中根据脑压情况决定是否保留颅骨骨瓣,术后给予脱水降颅压、止血、营养神经等药物治疗,病情稳定后转康复科行神经功能康复。

1.2.2 免疫组织化学检测 石蜡组织块切片后,0.3%过氧化氢甲醇溶液［30%过氧化氢1 ml+甲醇80 ml+磷酸缓冲盐溶液(PBS) 19 ml］处理30 min,0.3%Triton X-100 的PBS 处理 30 min,然后浸入鼠抗TLR4 单克隆抗体(1∶100)孵育48 h(4℃),浸入生物素化兔抗小鼠二抗(1∶500)孵育2 h(室温),浸入亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)(1∶500)孵育2 h(室温),蒸馏水快速冲洗后在DAB-H2O2溶液中进行呈色反应20～30 min,当阳性产物呈棕褐色而背底清晰时终止显色。以上步骤每步后均需0.01 mol/L PBS 清洗3 次,10 min/次。其中一抗用含1%牛血清和0.3%的Triton X-100 的PBS 稀释,二抗和ABC 复合物用PBS 稀释。贴片,脱水,透明,中性树胶封片。在5 个高倍视野(400×)计数破裂动脉与颞浅动脉壁中TLR4 免疫反应阳性细胞个数,取平均数。

1.3 统计学方法 采用SPSS24.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗结果 手术后均复查头颅CT,脑内血肿清除程度为76%～95%,神经外科住院时间14～35 d,平均住院时间21.4 d,随访6～12 月,无死亡病例,20 例均意识恢复,对侧肢体肌力0～4 级,均遗留不同程度对侧肢体偏瘫症状。

2.2 免疫组织化学检测结果 20 例患者中破裂动脉TLR4 表达呈阳性,而颞浅动脉TLR4 低表达。见图1。

2.3 TLR4 表达阳性细胞计数 破裂动脉每400×高倍视野下TLR4 表达阳性细胞数为(31.35±3.08),高于颞浅动脉的(3.36±1.17),差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 TLR4 免疫组织化学染色后破裂动脉与颞浅动脉的表达

图2 每400×高倍视野下TLR4 表达阳性细胞数(aP<0.05)

3 讨论

高血压脑出血是临床常见的一种严重脑血管疾病,其中最常见的是基底节区脑出血,占所有高血压脑出血患者的40%～50%。脑内小动脉本身具有不同于其他小动脉的一些组织学特点,如血管壁较薄、血管周围无坚实的组织支持,故较其他脏器较容易发生出血。同时长期的高血压可以造成小动脉的内膜损伤,血浆中的某些成分通过损伤的内膜进入内膜下层,引起自身免疫反应介导的炎性反应,形成硬化、斑块甚至玻璃样变,这使得脑动脉内膜的完整性受到损害,以至形成微动脉瘤或管壁坏死。近年来,许多研究发现细小动脉的病理变化在脑出血的发病机制中占有十分重要的地位,其中尤以细小动脉硬化及玻璃样变性为高血压脑出血的首要血管病理改变［1,2］。

动脉硬化及斑块形成是多方面因素相互作用的结果,炎症反应、脂质代谢紊乱、内皮功能失调、氧化应激、机械力学、理化因素等多种发病机制参与动脉硬化和血管重塑的形成［3-5］。随着近年来基础研究及科研水平的不断进步,对脑动脉硬化形成及其发生发展规律的研究也逐渐由细胞水平深入到分子水平,发现在动脉硬化过程中,伴有免疫反应的慢性炎症过程在动脉硬化的发生发展过程中起着决定性作用［5,6］。

TLR 是免疫细胞表面识别病原相关分子模式的一种模式识别家族受体,其作为一类重要的蛋白质分子参与非特异性免疫(天然免疫)。经过十多年的探索,已陆续发现10 余个TLRs 家族成员,其中TLR4 与动脉粥样硬化形成关系较为密切［7］。TLR4 主要在髓源性细胞(如单核巨噬细胞)上表达,与特定的配体结合,激活细胞内活化通路,促使相关炎性因子和Ⅰ型干扰素的基因表达。在脑组织内,脑小血管病变诱发的认知障碍与海马组织内的TLR4 过表达和胶质细胞的炎性反应密切相关［8,9］。近年来,国内外越来越多的科研成果证实TLR(尤其TLR4)在动脉硬化斑块发生发展中发挥着重要作用,主要表现在慢性炎症和免疫反应的相互作用中起着决定性的桥梁作用［7,10］。Gibson等［11］研究揭示,TLR4 在动脉硬化病变血管内膜成纤维细胞中的表达较正常血管内膜升高,炎性因子在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作用下,刺激血管内平滑肌细胞,快速增生的平滑肌细胞具有催化动脉硬化斑块形成的作用。Michelsen 等［12］对敲除TLR4 基因小鼠研究表明,正常组小鼠的动脉硬化斑块面积及厚度明显高于TLR4 基因缺失小鼠,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)等因子也可使TLR4 在动脉硬化斑块组织中的表达量增加。越来越多的证据表明,TLR4 作为免疫反应和慢性炎症之间联系的桥梁,在动脉斑块形成过程中有着复杂的调控系统［13-15］。多种炎症因子或趋化因子可能通过TLRs 信号传导通路途径造成动脉硬化,而抑制TLRs 的表达则抑制动脉硬化的发生［16］。目前研究认为［17］,TLR4 的信号通路主要有两条途径：一条是髓样分化因子 88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)途径,另一条是MyD88 非依赖途径。最新研究表明,在实验脑出血大鼠模型中,激活TLR4-MyD88-JNK(Jun N-terminal kinase)信号通路能够促进脑组织的炎性反应,进而促进神经组织凋亡［18］。当胞外信号传递到胞内,胞内结构域TIR 与MyD88 的羟基端结合,同时 MyD88 氨基端再与白细胞介素-1(IL-1)受体相关激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4,IRAK4)结合,激活IRAK4。IRAK4 磷酸化后与MyD88 分离,进一步和肿瘤坏死因子(TNF)相关受体因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)相互作用。TRAF6 激活核因子κB(NF-κB)抑制物的激酶(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinases,IKKs)复合体,诱导IκB (Inhibitor of nuclear factor kappa-B)磷酸化。磷酸化的IκB 从复合物中分离出来,直接靶向泛素化和蛋白酶体降解,从而激活转录因子NF-κB。释放的NF-κB 位于细胞核,介导多种促炎细胞因子基因的表达［19］。IKKs 的信号通路激活MAPK 级联导致另一个转录因子激活蛋白-1(AP-1)的激活。它们都在促炎细胞因子的表达中发挥重要作用［20］。通过抑制TLR4/NF-κB 通路可以减轻血管内皮细胞炎性反应,减弱血管内皮细胞损伤［21,22］。MyD88 非依赖途径是由易位关联膜蛋白(Translocating chain-associated membrane protein,TRAM)启动的。依赖β 干扰素TIR 结构域连接蛋白(TIR domaincontaining adaptor inducing IFN-β,TRIF) 被 招募后,与IKKs 相互作用,实现转录因子IRF3 的磷酸化［23］。TRIF 还能与IRAK1 相互作用,激活转录因子干扰素调节因子7(Interferon regulatory factory 7,IRF7)。激活的IRFs 转移到细胞核,与DNA 结合,产生β 型干扰素(IFN-β)等抗病毒分子［24］。TRIF 还通过受体相互作用蛋白1(Receptor-interacting protein 1,RIP1)来激活MyD88 非依赖的NF-κB 途径。RIP1 与TRIF结合,导致Fas 相关的死亡域依赖性凋亡和NF-κB激活［25］。目前TLR4 在动脉粥样硬化疾病作用中的研究大多集中在颈动脉、冠状动脉和周围动脉,对脑细小动脉硬化形成的研究相对较少,许多研究主要在动物模型或者尸检组织中进行,缺乏直接在高血压基底节区脑出血患者破裂动脉上TLR4 表达情况的研究及相关性的分析。

本研究在手术中直接切取高血压基底节区脑出血患者已破裂动脉止血后的残端,然后应用免疫组织化学技术检测TLR4 在其的表达情况,并与同一患者头皮切口中切开颞浅动脉分支的表达情况进行对比,分析TLR4 与破裂动脉病理改变的相关性,直接在人类组织验证TLR4 促进脑动脉硬化形成的作用,结果显示破裂动脉TLR4 较高的表达,而颞浅动脉TLR4 低表达,提示了TLR4 在脑细小动脉硬化形成中有一定的作用,是高血压基底节区脑出血的部分原因,为寻找新的干预靶点提供了一定的实验依据,为高血压脑出血的防治提供了一种思路。