HBV相关慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ检测的临床意义

张 璎，成若晨，郭 蕊，王 霞，刘凯歌

1 西安医学院第二附属医院 康复医学科，西安 710038； 2 西安医学院 临床医学院1625班，西安 710068；3 咸阳市中心医院 老年病科，陕西 咸阳 712000； 4 西安医学院第一附属医院 消化内科，西安 710077

慢性乙型肝炎(CHB)是常见的慢性、进行性肝病，其发病率高，CHB可进展为肝纤维化、肝硬化(LC)甚至肝细胞癌(HCC)。我国LC和HCC 患者由HBV所致者分别为77%和84%[1]，死亡率高。因此，延缓及阻断肝病进展对改善预后至关重要，其关键是肝损伤的早期预警、评估及治疗。目前各临床检测指标均有一定的局限性，进一步寻找新的指标具有重要意义。原卟啉Ⅸ(protoporphyrins Ⅸ，PPⅨ)是血红素生物合成途径的最终中间体，其水平变化与肝脏疾病关系密切[2]。本研究拟通过探讨PPⅨ检测在HBV相关慢性肝病患者肝损伤中的价值，以期为HBV相关慢性肝病的诊治提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究病例组为2018年10月—2019年10月就诊于西安医学院第一附属医院诊断为HBV相关慢性肝病患者110例，其中CHB患者50例，LC患者40例，HCC患者20例。CHB患者根据转氨酶是否升高进一步分为静止期(转氨酶正常)与活动期(转氨酶升高)，LC患者根据Child-Pugh评分分为代偿期(Child-Pugh A级)与失代偿期(Child-Pugh B、C级)。纳入标准：参照《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[3]。排除标准：(1)原发性卟啉病、继发性卟啉病非肝脏因素(如铅中毒、巴比妥、磺胺、卡马西平及其他非甾体类抗炎药、雌激素等导致者；(2)合并严重心、脑、肾、肺、血液、内分泌等原发疾病者；(3)非HBV感染的慢性肝病，如非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、药物性肝炎、丙型肝炎、自身免疫性肝病、血吸虫性肝病等；(4)系统性红斑狼疮、干燥综合征等自身免疫性疾病。对照组为同一时期在本院健康体检人群40例，经检查均无HBV感染，肝功能均在正常范围，也无其他疾病。

1.2 检测项目及方法

1.2.1 常规检查 常规检查均在本院完成，包括HBV血清标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)、HBV DNA定量、AFP、血常规、肝功能、凝血功能等指标。肝胆胰脾彩超、FibroScan、腹部CT、胃十二指肠镜等检查均由操作熟练、经验丰富的医师完成。

1.2.2 血清PPⅨ检测 血清样品来自于西安医学院第一附属医院，禁食、禁水12 h后，清晨空腹采集5 ml外周静脉血避光离心，取上清液分装于1.5 ml避光EP管中-80 ℃冻存。采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测血清PPⅨ，在西安医学院药物分析测试中心完成。

(1)主要仪器及试剂：安捷伦1260 HPLC仪、配套二元泵、荧光检测器以及数据处理软件工作站(Agilent，美国)。PPⅨ标准品(上海源叶生物科技有限公司)。

(2)色谱条件：美国Agilent 5 TC-C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm),柱温30 ℃；流动相 A纯净水(含0.5%冰乙酸)，B甲醇∶乙腈∶DMF=45∶45∶10，以B∶A=95∶5等度洗脱。流速1 ml/min，激发波长400 nm，发射波长630 nm,增益16。

(3)PPⅨ标准品混合液配置：精密称取PPⅨ标准品1 mg溶于1 ml DMF溶液中配置浓度为1 mg/ml的标准溶液，再逐级稀释至浓度分别为100、70、30、10、7、3、1 ng/dl，作为实验中测定血清中PPⅨ的校正集。

(4)标准曲线绘制：按上述色谱条件及稀释浓度进行分析，每次进样20 μl，连续进样3次取平均峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标(ng/dl)，绘制标准曲线为Y=0.246 4X+0.308 6，R2=0.999 8，最低检测浓度0.1 ng/dl，标准曲线检测范围：1～100 ng/dl。

(5)血样处理及检测：解冻血浆样品300 μl加700 μl甲醇定容至1 ml，震荡，高速冷冻离心后取上清液进行含量测定，每份样品进样3次取平均值。根据标准曲线计算被检者血清PPⅨ。HPLC法检测PPⅨ标品、血样出峰图像如下(图1)。

注：a，原卟啉Ⅸ标准品；b，对照组；c，病例组。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由西安医学院第一附属医院伦理委员会审批，批号：XYYFY2021LSK-002，所有研究对象均签署知情同意书。

2 结果

2.1 基本资料的比较 CHB组、LC组、HCC组与对照组在性别、年龄上比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表1)。

表1 患者基本资料的比较

2.2 各组血清PPⅨ检测结果 (1)Kruskal-WallisH检验显示，CHB、LC、HCC 3组肝病患者血清PPⅨ显著高于对照组[44.29(25.99～85.36)ng/dl、72.73(48.28～90.43)ng/dl、91.79(68.34～121.52)ng/dl vs 15.43(10.87～20.16)ng/dl]，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。HCC组较CHB、LC组PPⅨ显著升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(图2)。(2)Mann-WhitneyU检验显示，与代偿期LC患者相比较，失代偿期LC患者PPⅨ显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；而CHB患者活动期与静止期PPⅨ比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

图2 对照组与病例组血清PPⅨ水平

表2 CHB与LC患者组内PPⅨ水平

2.3 PPⅨ诊断HBV相关慢性肝病的效能 ROC曲线显示，PPⅨ诊断CHB的曲线下面积(AUC)为0.873，95%CI：0.797～0.949，利用约登指数确定临界值为20.325ng/dl，其敏感度为86%，特异度为77.5%；诊断LC的AUC为0.748，95%CI：0.659～0.838，临界值为33.695 ng/dl，其敏感度为90%，特异度为61.1%；诊断HCC的AUC为0.812，95%CI：0.729～0.896，临界值为65.26 ng/dl，其敏感度为85%，特异度为69.2%(图3)。

注：a，PPⅨ诊断CHB的ROC曲线；b，PPⅨ诊断LC的ROC曲线；c，PPⅨ诊断HCC的ROC曲线。

2.4 CHB静止期与对照组PPⅨ及肝功能比较 静止期CHB患者肝功能指标除ChE较健康对照组升高外(P=0.032)，其余指标与对照组相比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)；而CHB患者的PPⅨ显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 CHB患者静止期与对照组PPⅨ及肝功能指标比较

2.5 PPⅨ与各肝功能评估指标的相关性分析 CHB患者PPⅨ与各指标均不存在相关性(P值均>0.05)；LC患者PPⅨ与TBil呈中等正相关(rs=0.587，P<0.05)，与Alb呈中等负相关(rs=-0.408，P<0.05)；HCC患者PPⅨ与TBil呈中等正相关(rs=0.470，P<0.05)，与ChE呈中等负相关(rs=-0.459，P<0.05)(表4)。

表4 PPⅨ与各指标的相关性分析

3 讨论

HBV感染是全球最重大公共卫生安全问题之一，可进展为CHB甚至LC、HCC等终末期肝病，给患者和社会造成沉重的负担，同时挤占大量的医疗资源。而早期预防及治疗，对于阻止疾病进展及改善预后具有重要意义。CHB的发病机制较为复杂，迄今尚未完全阐明，目前认为肝细胞损害主要是由HBV引起的免疫应答反应所导致[1]。此外，HBV诱导线粒体氧化应激、线粒体自噬以及释放炎性因子可能是肝病进展的重要原因[4]。PPⅨ是血红素生物合成途径的最终中间体，起始和终末两个关键步骤均在肝细胞线粒体进行[2]，遗传性和后天性疾病以及某些外源生物可能干扰血红素的合成和PPⅨ的体内平衡，导致PPⅨ的蓄积[5]。大量的PPⅨ具有肝毒性，损害肝细胞和胆管细胞，肝细胞损伤后肝脏对PPⅨ的清除作用进一步减弱，血浆和红细胞中PPⅨ水平可逐渐升高[5]。研究[6]表明，HBV或许影响肝细胞内PPⅨ代谢和血红素合成，而PPⅨ与HBV相关慢性肝病进展的关系及其能否用于肝损伤的早期预警及病情评估鲜有报道。

本研究利用HPLC法，高效、高灵敏的检测了对照组和慢性肝病患者的血清PPⅨ。结果显示，在HBV感染者疾病进程的不同阶段均存在PPⅨ表达异常。与对照组相比，肝病患者的PPⅨ显著升高，这与以往的研究结果一致[7-9]，也验证了该方法的有效性。Nakano等[10]研究发现，HCV核心蛋白可以增加猫白血病病毒C亚类受体1(feline leukemia virus subgroup C receptor 1, FLVCR1)和药物转运体ATP结合盒G家族成员2(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG2)的mRNA表达，降低ATP结合盒B家族成员6(ATP-binding cassette subfamily B member 6, ABCB6)的mRNA表达，HBV核心蛋白同样如此[6]。FLVCR1是转运蛋白促进因子超家族成员，可以输出血红素和PPⅨ[11]；ABCG2主要定位于细胞外膜和线粒体膜，负责PPⅨ的外排；而ABCB6是线粒体卟啉摄取所必需的[12]，其表达水平直接影响细胞内的PPⅨ浓度[13]。HBV感染者血清中PPⅨ升高可能是HBV核心蛋白通过增加卟啉转运体FLVCR1和 ABCG2的表达，降低ABCB6的表达，使PPⅨ从肝细胞输出增加，输入减少，导致血浆中PPⅨ水平升高。同时，HBV可引起线粒体功能障碍和氧化应激[6,14]，导致血红素合成障碍和PPⅨ的蓄积，造成肝细胞损害。血红素合成减少负反馈引起卟啉合成限速酶氨基 γ 酮戊酸合成酶1的增加，又加速了PPⅨ的合成。肝细胞损害也使PPⅨ的清除能力下降，肝肠循环增加，导致血清中PPⅨ水平进一步升高。

PPⅨ增减与肝病轻重，特别是肝损伤程度密切相关[7]，血清PPⅨ还可能与慢性肝病进展呈活动度依赖性，CHB患者活动期与静止期PPⅨ相比差异无统计学意义，可能与纳入CHB患者肝损伤普遍较轻及样本量较小有关。与代偿期LC患者相比，失代偿期患者肝功能严重受损，PPⅨ水平也显著升高，说明PPⅨ检测不但能反映肝损伤，还能帮助判断病情进展情况。本研究发现HCC患者PPⅨ较CHB、LC患者均显著增加，说明HCC时卟啉代谢紊乱较慢性肝病更为突出。线粒体功能障碍已被认为是癌症的标志[15]，肝癌患者PPⅨ显著升高可能是因为线粒体功能障碍引起氧化应激从而干扰卟啉代谢和血红素的生成。也有学者[9]认为可能是恶性肿瘤刺激机体卟啉代谢的某个限速酶，使其活性增强，产生大量PPⅨ超过了机体对其的利用，导致血中PPⅨ水平显著升高。

研究[7,16]证实HBV感染者PPⅨ水平与肝病进展相关，但目前仅有一项研究[9]调查了PPⅨ在HCC患者中的诊断价值，PPⅨ能否作为CHB、LC和HCC鉴别诊断的潜在标志物，目前尚未阐明。本研究通过ROC曲线分析显示，当PPⅨ取最佳临界值20.325、33.695、65.26 ng/dl时，采用PPⅨ诊断CHB、LC和HCC的敏感度均在85%以上，特异度均在60%以上，说明PPⅨ对HBV相关慢性肝病诊断的敏感度较高，但特异度特差，因此PPⅨ不具备诊断价值。进一步对静止期CHB患者和对照组的PPⅨ水平和肝功能指标进行分析发现，静止期CHB患者肝功能指标与对照组相比，无明显变化，而PPⅨ水平显著高于健康对照组，提示PPⅨ是肝损伤的早期事件。在慢性HBV感染时，HBV最早损伤肝细胞线粒体，作为PPⅨ代谢的主要细胞器，线粒体的损伤影响了PPⅨ的正常代谢，此时肝细胞的其他亚细胞器未损伤，表现为胆红素、转氨酶等反映肝损伤的指标均正常，而血清PPⅨ异常。因此PPⅨ是反映肝脏早期轻微损伤的敏感指标，具有作为HBV肝损伤的早期预警潜质，可能用于急性、活动性、慢加急性肝损伤或肝衰竭等的预警、转归及预后评估。

Spearman相关性分析表明PPⅨ水平可能与肝功能障碍和胆汁淤积的程度有关，这与国外学者的报道相一致[8,17]。HBV损伤肝细胞，使胆红素和PPⅨ摄取、代谢和排泄能力降低，血清中胆红素和PPⅨ水平升高。血清中的PPⅨ既有游离态的，又存在和蛋白质结合形式的，血清白蛋白能够作为PPⅨ的载体参与物质转运[18]。卟啉转运蛋白FLVCR1输出血红素受到细胞外血红素结合蛋白和Alb的严格控制，在缺乏载体蛋白的情况下FLVCR不能输出血红素[11]。本研究LC和HCC组PPⅨ显著升高，可能与患者Alb合成减少，输出血红素亦减少导致PPⅨ的蓄积有关，也说明PPⅨ可作为肝损伤的评估指标。本研究发现HBV感染者PPⅨ不与ALT、AST呈显著的相关性，这可能与ALT、AST仅在肝细胞出现明显炎症及坏死时才升高有关，也可能是反映肝损伤的不同发病机理或不同分子通路。

综上所述，HBV相关慢性肝病患者血清PPⅨ显著升高，且与慢性肝病进展呈活动度依赖性，可作为肝损伤的早期预警和病情评估的潜在临床指标，对评价肝损伤程度、判断肝脏储备功能、协助慢性肝病诊治具有一定的临床意义。同时，由于本研究样本量较小和样本的局限性，其结果推广应用有待进一步研究。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：张璎、成若晨负责课题设计，资料分析，撰写论文；郭蕊、王霞参与收集数据与样本检测；刘凯歌负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。