靶向适应性免疫治愈慢性乙型肝炎策略及进展

朱 伟，张小勇，张大千，侯金林

南方医科大学南方医院 感染内科肝病中心，广州510515

HBV属于嗜肝病毒科、是大小约为3.2 kb的双链DNA包膜病毒[1]。虽然乙型肝炎预防性疫苗被广泛应用，但全球范围内依然约有2.5亿人处于慢性HBV感染状态，而持续的慢性HBV感染易导致肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌的发生与发展，造成严重的全球公共卫生负担[2]。目前治疗慢性乙型肝炎(CHB)的主要药物包括核苷(酸)类似物和IFN，由于上述药物无法清除作为病毒RNA转录模板的共价闭合环状DNA(cccDNA)而无法有效清除HBV。目前CHB治疗的目标是停止抗病毒治疗后，患者血清中HBsAg检测阴性、HBV DNA检测阴性、肝脏生化指标正常及肝组织病变改善，即CHB的功能性治愈[3]。适应性免疫应答对于控制HBV感染起到极其重要的作用，因此通过靶向适应性免疫的手段进而治愈CHB的策略备受关注。

1 适应性免疫在HBV感染中的作用

适应性免疫应答是由体液免疫和细胞免疫组成的复杂系统，在清除游离HBV、防止HBV扩散及清除HBV感染的肝细胞过程中发挥核心作用，同时也是造成肝损伤的主要原因。

1.1 T淋巴细胞 HBV特异性CD8+T淋巴细胞可通过细胞毒效应及非细胞毒效应清除HBV感染[4]。HBV的清除伴随着强烈、多靶点CD8+T淋巴细胞免疫应答。清除CD8+T淋巴细胞导致HBV感染的慢性化。CD4+T淋巴细胞在诱导高效B淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞免疫应答过程中必不可少，因此HBV特异性CD4+T淋巴细胞对于控制HBV感染亦至关重要。研究[5]表明，HBV特异性CD4+T淋巴细胞在HBV感染后的7～10周即可被检测到，这与HBV特异性抗体及CD8+T淋巴细胞出现的时间一致。在急性自限性HBV感染中，外周血中辅助性T淋巴细胞(Th)1极化的CD4+T淋巴细胞可以有效控制病毒感染[6]。虽然感染HBV后，敲除CD4+T淋巴细胞不影响HBV的清除，但感染前敲除CD4+T淋巴细胞可导致HBV特异性CD8+T淋巴细胞的缺陷从而导致HBV感染慢性化[7]。此外，CD4+调节性T淋巴细胞(Treg)是一种免疫负调节细胞，在慢性HBV感染中发挥抑制T淋巴细胞活化、增殖及IFN产生的功能[8]。

1.2 B淋巴细胞 抗-HBs不仅可以预防HBV感染，还可促进HBV的清除。研究[9]表明，靶向HBsAg中和抗体不但降低HBsAg还可减少HBV的传播及恢复HBV特异性T淋巴细胞免疫应答。拥有抗-HBs的CHB患者发生HBV再激活的风险比单纯拥有抗-HBc的患者更低[10]。利妥昔单克隆抗体清除B淋巴细胞导致HBV再激活亦证明B淋巴细胞介导的体液免疫可促进HBV的清除[11]。

1.3 树突状细胞(DC) 作为功能最强的专职抗原递呈细胞，DC在天然免疫及适应性免疫中均发挥极其重要的作用。DC具有广泛的模式识别受体，其中Toll样受体是最具特征的，并在识别病毒或病毒抗原中发挥主要作用。DC和感染HBV肝细胞的抗原递呈功能是初次激活HBV特异性T淋巴细胞的关键。DC可通过内源性抗原递呈或交差递呈、共刺激分子及细胞因子等途径初次激活CD4+T及CD8+T淋巴细胞。由于HBV不感染DC，所以DC只能通过交差递呈方式递呈HBV抗原并激活T淋巴细胞。当DC抗原递呈或细胞因子分泌功能受损时便会抑制HBV特异性T淋巴细胞的形成进而抑制HBV特异性细胞及体液免疫。

2 抗HBV适应性免疫的紊乱

感染HBV后，90%的婴儿及5%的成年人会发展成CHB[12]。HBV感染慢性化的原因包括宿主因素及病毒因素，靶向HBV适应性免疫系统紊乱是HBV感染慢性化主要原因。研究HBV适应性免疫应答的特点及其在HBV感染慢性化中的机制是研发HBV治愈策略的基础之一。

2.1 T淋巴细胞 CD8+T及CD4+T淋巴细胞主要通过细胞表面的主要组织相容复合物-抗原肽复合物识别HBV感染的肝细胞。肝细胞主要组织相容复合物下调、HBV抗原突变及HBV抗原突变对蛋白酶体降解抵抗导致T淋巴细胞无法识别HBV感染的肝细胞，进而促进HBV感染慢性化[13-14]。T淋巴细胞的耗竭也是CHB的特征之一，由于长期暴露于HBV抗原，HBV特异性T淋巴细胞逐渐失去正常的细胞因子分泌及细胞毒功能并表达多种抑制性受体，包括程序性死亡受体(programmed death-1，PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4)、T淋巴细胞免疫球蛋白黏液素(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte-activation gene-3，Lag-3)、含Ig及ITIM结构域的T淋巴细胞免疫受体(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT)及Bcl-2相互作用细胞死亡介导因子(bcl-2 interacting mediator cell death，BIM)等，通常抑制性受体在维持自身免疫耐受机制中起到核心作用。抗原刺激的水平和持续时间与慢性感染期间功能障碍的严重程度相关，耗竭的T淋巴细胞共表达的抑制性受体数量越高，T淋巴细胞耗竭的水平就越严重[15]。滤泡状辅助CD4+T淋巴细胞(follicular helper CD4+T cells，Tfh)在维持生发中心的成熟及B淋巴细胞分化为浆细胞的过程中及其重要[16]。Tfh减少以及功能紊乱影响HBV特异性B淋巴细胞的分化及抗体生成，造成了HBV持续感染[17]。Treg主要作用是维持免疫耐受，可抑制T淋巴细胞的活化增殖及DC的成熟。CHB患者中Treg显著增多，并且Treg的含量与血清HBV病毒载量正相关[18]。Treg/Th17的失衡是HBV相关肝硬化进展的指标及肝细胞癌发生的风险因素[19]。此外，Treg也在HBV相关肝细胞癌中显著富集[20]。

2.2 B淋巴细胞 HBV感染同样损伤B淋巴细胞功能。CHB患者外周血B淋巴细胞显示更高的激活表型以及增殖缺陷[21]、抗体分泌功能减弱、分泌IL-10的不成熟调节性B淋巴细胞比例增加[22]。调节性B淋巴细胞不仅抑制细胞毒性T淋巴细胞的功能还促进CD4+T淋巴细胞向Treg细胞分化发挥细胞免疫抑制作用[23]。

2.3 树突状细胞(DC) 虽然HBV不感染DC，但CHB患者的DC数量及功能依然存在异常。研究[24]表明，CHB患者外周血来源的表达CD80、CD86的成熟髓样DC细胞比例显著降低。此外HBsAg和HBeAg均可抑制DC体外的功能[25]。抗病毒治疗可抑制髓样DC PD-L1的表达，恢复T淋巴细胞功能[26]。值得注意的是，虽然没有直接证据证明CHB患者DC的非靶向HBV的细胞体液免疫受损，但与高病毒载量CHB患者相比，低病毒载量CHB患者拥有更高质量的DC[27]。

3 靶向适应性免疫系统治愈CHB策略

由于适应性免疫系统在HBV慢性感染中处于紊乱状态，因此通过重建或逆转HBV特异性的免疫策略是治愈乙型肝炎的突破点之一。目前靶向适应性免疫系统治愈乙型肝炎策略主要包括治疗性疫苗、细胞免疫治疗、免疫检查点阻滞、T淋巴细胞代谢重编程及中和抗体疗法(图1)。近期开展的相关临床试验见表1。

图1 靶向适应性免疫系统治愈CHB策略

表1 靶向适应性免疫系统治疗CHB的临床试验

3.1 治疗性疫苗

理想的HBV治疗性疫苗需要诱导强大的HBV特异性T、B淋巴细胞免疫应答并恢复耗竭HBV特异性T、B淋巴细胞的功能。虽然目前尚未有HBV治疗性疫苗上市，但多项HBV治疗性疫苗临床试验已显示出一定的治疗效果。为进一步提高HBV治疗性疫苗的疗效并成功应用于临床，HBV治疗性疫苗亦需要在疫苗构型、递送系统及抗原选择上进一步优化。

3.1.1 GS-4774 GS-4774是基于重组、热灭活酵母疫苗，表达HBsAg、HBcAg及X抗原。GS-4774疫苗联合直接抗病毒药的临床试验结果显示，接种疫苗组中，约11%(5/44)的患者HBeAg消失，约9%(4/44)患者抗-HBe转阳，HBV特异性T淋巴细胞免疫应答增强，而对照组无HBeAg消失或抗-HBe转阳患者[28]。GS-4774疫苗联合替诺福韦的临床试验结果提示，与替诺福韦单药治疗组相比，联合治疗组患者HBV特异性CD8+T淋巴细胞分泌更多TNF、IFNγ、IL-2细胞因子，其增强的T淋巴细胞功能与Treg数量呈反比[29]。

3.1.2 HB-110 HB-110是DNA疫苗，表达HBsAg、HBcAg、pre-S1、pre-S2、Pol及IL-12。该疫苗诱导靶向HBsAg、HBcAg、Pol的特异性免疫应答。约19%(5/27)的患者体内可检测到分泌TNF、IFNγ、CD107的多功能特异性CD8+T淋巴细胞。促进并维持部分患者HBeAg的血清学转换[30]。

3.1.3 TG1050 TG1050是腺病毒(Ad5)疫苗，表达HBcAg、Pol及部分HBsAg。在小鼠实验中发现，单次给药后，TG1050诱导了健壮的、多特异性的、多功能及持久的HBV特异性T淋巴细胞，这些特异性的T淋巴细胞在TG1050注射1年后仍可检测到[31]。临床试验结果表明中高剂量组中，80%的患者产生靶向至少一种HBV抗原的特异性免疫应答并导致轻微的HBsAg下降(0.4 log)[32]。

3.1.4 NASVAC NASVAC是蛋白疫苗，含有HBsAg、HBcAg。Ⅰ期临床试验结果表明NASVAC疫苗可在所有患者中诱导抗-HBc，75%患者体内检测到抗-HBs。Ⅲ期临床试验结果显示，与PEG-IFN治疗组相比，NASVAC疫苗显著降低了血清HBV病毒载量并诱导更高的HBeAg血清转换率[33]。

3.2 细胞免疫治疗

细胞免疫疗法已在血液瘤治疗中取得了重大突破，目前FDA已批准5款靶向CD19的嵌合抗原受体T淋巴细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)治疗产品。细胞免疫疗法也被用于探索HIV、HBV等病毒感染性疾病的治疗。将拥有HBV免疫能力患者的骨髓移植给患有CHB的白血病患者可清除CHB患者体内HBV[34]。因此输注HBV特异性细胞可成功清除HBV，甚至可以治愈乙型肝炎。

3.2.1 工程T淋巴细胞 90%成人急性HBV感染出现自发性HBsAg清除，同时伴有强烈的T淋巴细胞免疫应答。而慢性乙型肝炎患者由于多种耐受机制导致缺乏足够HBV特异性T淋巴细胞进而无法清除病毒，因此过继输注HBV特异性的工程T淋巴细胞是一种可行的乙型肝炎治疗策略。目前工程T淋巴细胞主要包括T淋巴细胞受体T淋巴细胞(T cell receptor T-cell，TCR-T)和CAR-T。用于治疗HBV感染的主要靶点为HBsAg和HBcAg。靶向HBsAg的CAR-T淋巴细胞特异性识别并杀伤HBsAg阳性的HepG2.2.15细胞[35]，在人源化HBV小鼠模型体内扩增及显著抑制HBV复制，同时诱导短暂的肝损伤[36]。在人肝嵌合小鼠模型中显著降低血清HBsAg、病毒载量及HBV感染肝细胞的比例[37]。HBsAg特异性TCR-T可以识别HBV感染的肝细胞并显著降低人源化HBV小鼠模型中HBV DNA[38]。亲和力增强的TCR-T即保留了HBV抗原特异性，还可识别广泛的HBV基因型变异，具有更好的抗原识别敏感性和细胞毒性，该TCR-T在小鼠模型中可以完全消除HBV相关肝癌并抑制其复发[39]。临床试验提示靶向HBsAg的TCR-T识别HBV相关肝癌细胞，在患者体内存活并增殖，同时降低HBsAg并且显示良好安全性[40]。过继性T淋巴细胞疗法的局限是成本高、治疗时间长。新型可溶TCR策略无需在体外处理T淋巴细胞，已被成功用于治疗HIV感染。这种可溶性TCR策略被称为抗病毒免疫激动单克隆T淋巴细胞受体(immune mobilising monoclonal TCRs against virus，ImmTAV)，它本质上属于一类新型的双特异性生物大分子，是由工程化改造的TCR以及抗-CD3的单链抗体组成。一款叫做IMV-I109V的ImmTAV可以有效激活T淋巴细胞并特异性清除整合了HBV DNA及HBV感染的肝细胞[41-42]。CHB的T淋巴细胞免疫疗法有待进一步在临床试验中研究。

3.2.2 DC细胞 髓系来源的DC调控HBV特异性T淋巴细胞的功能性分化，通过活化CD40信号通路恢复耗竭的HBV特异性T淋巴细胞的功能。HBsAg/HBcAg负载DC策略在小鼠模型中成功诱导HBV特异性T淋巴细胞免疫应答[43]。自体回输负载HBV抗原的DC可以有效抑制HBV复制，降低病毒载量，清除HBeAg并诱导HBeAg血清学转化，甚至导致HBsAg清除[44]。另一种基于DC的细胞疗法是树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK)。DC-CIK疗法是将DC与CIK共培养同时负载抗原肽，诱导特异性的T、B淋巴细胞扩增并激活自然杀伤细胞，最终将DC和CIK自体细胞回输至患者体内。临床试验结果表明63.6% (21/33)的CHB患者在回输HBsAg激活的DC-CIK后病毒载量下降2 log[45]，有部分患者甚至出现HBsAg血清学转换[46]。由于DC免疫疗法用于CHB治疗的研究数量有限，因此该疗法有待进一步研究。

3.3 免疫检查点阻滞 耗竭T淋巴细胞表达特定的抑制性受体，利用抑制性受体抗体可部分恢复耗竭T淋巴细胞的功能。免疫检查点阻滞已应用于多种肿瘤治疗，在部分患者中显示出良好的疗效。CHB患者体内的HBV特异性T淋巴细胞同样存在功能缺陷并高表达PD-1、CTLA-4等抑制性受体。HBV感染导致肝细胞PD-L1表达升高更加重了HBV特异性T淋巴细胞的耗竭。多项研究显示利用PD-1阻滞至少可以在一定程度上恢复耗竭的HBV特异性T淋巴细胞。土拨鼠肝炎模型中，使用PD-L1抗体联合恩替卡韦和DNA疫苗成功增强HBV特异性T淋巴细胞功能，导致病毒的持续控制以及抗-土拨鼠肝炎表面抗原的产生，甚至清除部分土拨鼠肝炎病毒感染[47]。PD-L1增强来源于HBeAg阴性患者的OX40活化的HBV特异性CD4+T淋巴细胞功能，分泌更多的IFNγ和IL-21，因此PD-1免疫检查点阻滞联合OX40激动剂可能更有利于乙型肝炎治愈[48]。不同的T淋巴细胞亚群、CD28共刺激分子及抑制性受体表达水平均会影响免疫检查点阻滞的敏感性，并可作为预测疗效的指标[49-51]。与外周血淋巴细胞相比，肝内淋巴细胞甚至展示出更佳的PD-L1阻滞治疗的敏感性[26]。PD-1免疫检查点抑制剂纳武利尤单抗治疗病毒抑制状态的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的临床试验结果显示，大多数纳武利尤单抗治疗患者的HBsAg水平下降，其中1例患者在治疗后发生HBsAg血清学转换及HBsAg特异性T淋巴细胞显著增加[52]。除了PD-1/PD-L1分子，阻滞其他免疫检查点如Tim-3、CTLA-4亦有望恢复HBV特异性T淋巴细胞的功能。

3.4 T淋巴细胞代谢重编程 T淋巴细胞的分化、激活以及记忆性表型的产生均需要代谢过程参与。越来越多的研究表明T淋巴细胞耗竭与代谢紊乱有关，T淋巴细胞早期代谢的改变甚至发生在病毒特异性T淋巴细胞严重耗竭之前[53]，靶向特定代谢通路可恢复T淋巴细胞功能[54]。慢性HBV感染过程中，HBV特异性T淋巴细胞的线粒体功能紊乱并且产生过量活性氧，导致T淋巴细胞生物合成及能量代谢障碍；利用靶向线粒体抗氧化剂可明显恢复患者外周血或肝内HBV特异性T淋巴细胞的功能[55-56]。目前尚未有靶向线粒体方法治疗CHB临床试验的报道。

3.5 HBV中和抗体 HBV通过肝细胞表面的受体感染肝细胞，因此利用抗体封闭HBV感染肝细胞的受体可以用来治疗HBV感染。抗-HBs的单克隆抗体E6F6在多种HBV小鼠模型中具有显著的抗病毒作用，单次治疗即可显著降低HBsAg和3log以上的HBV DNA；E6F6抗体在人肝嵌合小鼠模型中不仅可以预防HBV感染还可减少HBV的二次传播，在高压注射HBV模型中恢复HBV特异性T淋巴细胞应答；Fcγ受体依赖的吞噬作用在E6F6介导的HBV抑制中起主导作用；此外抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用及补体依赖的细胞毒性作用可能也参与了E6F6抗体的抗HBV作用[9,57]。HBV中和抗体VIR-3434的Ⅰ期临床试验结果显示，6例患者接受了单剂量 6 mg VIR-3434 的用药8 d后，血清HBsAg水平平均降低了1.3 log[58]。

4 结论及展望

HBV适应性免疫应答紊乱造成HBV的持续感染，重建HBV适应性免疫应答是治愈乙型肝炎的重要思路。虽然利用治疗性疫苗、细胞免疫治疗、免疫检查点阻滞、T淋巴细胞代谢重编程、HBV中和抗体等疗法可部分恢复HBV特异性免疫并在不同程度抑制HBV复制及降低血清HBsAg，甚至使部分患者达到功能性治愈，但无法在多数患者中有效清除HBV。目前尚需进一步研究CHB过程中HBV免疫病理机制，以改进优化上述疗法。靶向适应性免疫疗法联合靶向天然免疫系统及直接抗病毒药物的个体化疗法可能更易实现清除HBV以及HBsAg血清学转换，最终实现CHB功能性治愈的目标。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：朱伟、张小勇、张大千、侯金林负责提出研究选题，撰写论文和修订论文。