百合的组织培养专利分析

陈佩 马彧博

(国家知识产权局专利局专利审查协作天津中心，天津 300304)

百合是百合科百合属多年生草本球根植物，百合花姿优雅，是世界著名的观赏花卉之一，全球已发现110多个品种，其中55种产于中国。百合除具有观赏价值外，其干燥的肉质鳞叶还可食用、药用，具有养阴润肺，清心安神之功效。传统的百合繁殖方法主要采用分球、分珠芽、鳞片扦插等。但是上述繁殖方法繁殖系数低且容易造成品种退化以及病毒的积累[1]，组织培养不受时间的限制，可以采用多种器官或者组织建立百合的再生体系，从而达到快速繁殖百合植株的目的。目前主要通过4种途径建立百合的再生体系，通过脱分化形成愈伤组织、再分化形成芽、增殖和生根培养得到再生植株；通过直接诱导不定芽，对不定芽进行增殖和生根培养得到再生植株；诱导小鳞茎途径，通过外植体诱导得到小鳞茎，对小鳞茎进行生根培养；体细胞胚状体途径，通过愈伤组织诱导得到球形胚或者外植体直接形成胚状体，进行分化培养得到再生植株[2]。另外，利用组织培养结合茎尖培养可以得到脱毒百合，将组织培养与农杆菌转化结合能得到产量高、品质优且抗逆性强的百合新品种；将组织培养与多倍体诱变结合能选育出更多的优良品种。本文以百合组织培养技术为入口进行专利检索和分析，揭示百合组培再生相关专利脉络，为企业或者研究院所提供信息。

1 百合组织培养技术中国发明专利申请情况

在国家知识产权局自主开发的专利检索与服务系统(S系统)和Incopat专利检索平台上以关键词结合分类号检索获取专利信息，共得到447篇专利文献。由于专利法规定自申请日起满18个月即行公布，也可以根据申请人的请求早日公布，即专利公布时间相对滞后，因此2019年及以后的数据仅作参考。

1.1 申请趋势分析

百合组培技术专利在中国的申请量分布见图1。

图1 百合种质技术专利在中国的申请分布

由图1可知，2002—2009年间，百合组培技术专利申请量较低；2011—2014年申请量处于增长阶段。尤其在2014年达到申请量的最高峰，可能与国家扶持农业产业化发展以及支持农业特色农产品发展的政策相关。如，国务院以国发〔2012〕10号印发《关于支持农业产业化龙头企业发展的意见》。另外，百合还可作为中药，国家也将中药材的发展作为经济发展的重要举措，如，国家2015年出台的《中药材保护和发展规划(2015—2020年)》、2016年印发的《中医药发展战略规划纲要(2016—2030年)》[3]。随着国家乡村振兴的实施，百合的组织培养技术也会不断增长。

1.2 百合组织培养专利中国申请主要申请人分析

由图2可以看出，百合组培专利相关的申请人主要是国内的高校和研究所，其中昆明理工大学和云南省农业科学院花卉研究所申请量较多，主要是因为云南昆明斗南国际花卉市场是亚洲第1花卉批发市场，百合花作为市场需求量广泛的花卉之一，在云南种植广泛。另外，北京林业大学、浙江大学以及长江师范学院申请量相当。可见，无论是北方、南方还是中部地区对百合组培研究都比较多。

图2 百合组培技术专利主要申请人及申请量

1.3 技术领域分布

通过统计专利设计的国际专利分类号(IPC)，对百合组培技术领域进行分析，如表1所示。百合主要的分类号是A01H，新植物或获得新植物的方法，通过组织培养技术的植物再生；C12N，微生物或酶，其组合物，繁殖、保藏或维持微生物，变异或遗传工程，培养基；C12Q包含酶、核酸或微生物的测定或检验方法。也有一定数量关于A01G园艺；蔬菜、花卉、稻、果树、葡萄、啤酒花或海菜的栽培。上述4个领域涵盖了组织培养再生，百合的遗传转化，培养基、百合育种中的检测以及百合的种植方向。

图3 技术领域分布

2 专利技术研究路线分析

2.1 外植体的选择

百合组培再生中鳞片是普遍采用的外植体，但鳞茎在土壤中带病毒较多，病毒在植株体内进行复制繁殖，在组织培养中容易出现真菌污染，同时继代培养的过程中也较容易出现内生细菌的再次污染，因此茎段、种胚/种子、花药、花丝也是常见的外植体类型。如，CN110810240A公开了以健康母株的茎段作为外植体，诱导不定芽和对不定芽增殖培养得到无菌苗的方法；CN110771501A公开了以百合种子进行萌发、分化得到无菌幼苗，并对幼苗进行增殖、鳞茎诱导和生根、炼苗移栽的方法；CN108633743A公开了以百合花药为外植体进行愈伤组织诱导再生的方法；CN103798142A公开了以百合花丝为外植体，诱导胚性愈伤组织得到污染率低、诱导率高、再生能力强、增殖率高的再生方法。

2.2 再生途径

在适宜的条件下培养茎段、茎尖、芽等器官，利用外植体已经存在的芽器官，通过以芽繁芽的再生方法得到完整植株是百合常见的器官型再生方式，在理论上该途径再生得到的后代基因型与母体基本一致，可较好地保持母本特性。如，CN108834895A公开了以百合茎尖为外植体，在MS加6-BA加NAA培养基中进行芽诱导和伸长培养得到再生植株的方法，该方法再生率高；CN106718873A公开了以百合的茎尖或腋芽为外植体进行不定芽诱导、不定芽增殖，繁殖系数可达4～5倍。

利用各分生组织或器官在添加植物激素的培养基中进行脱分化、再分化的愈伤途径也是百合常见的器官发生型再生途径。如，CN108633743A公开了以百合花药为外植体诱导愈伤组织，愈伤组织的诱导率达到35%以上；CN108450333A公开了以百合鳞片或珠芽接种在MS加6-BA加NAA加KT加2,4-D进行愈伤的诱导和不定芽的分化，20d就能得到愈伤组织，诱导率达71%；CN107173236A公开了以百合种子为外植体，接种在1/2MS加2,4-D加NAA加6-BA加杀菌中草药中进行愈伤组织诱导、继代培养的方法，该方法提高了百合愈伤组织的抗感染能力。

百合是常见的球根花卉，利用外植体在合适的条件下直接诱导形成带根的小鳞茎是百合再生中特殊的小鳞茎途径。CN107396835A公开了以百合中部或者基部鳞片为外植体进行不定芽诱导、鳞茎增殖的再生方法；CN107736251A公开了以鳞茎为外植体，在MS加IBA加细胞分裂素加油菜素内酯加茉莉酸甲酯诱导小鳞茎，并对鳞茎进行膨大、生根、催芽的再生方法，该方法提高了繁殖系数、缩短了繁殖周期；CN10754907A公开了对百合茎杆叶腋叶面喷施吲哚乙酸和表油菜素内酯的混合物进行茎生小鳞茎诱导、小鳞茎催芽生长的方法，每株可诱导6～10个小鳞茎，繁殖系数高。

在离体条件下，外植体产生类似胚胎的发生和发育的过程是百合再生中的体胚诱导途径，体细胞胚减少了植株的变异性。如，CN110972955A公开了以叶为外植体在MS加NAA加2,4-D/6-BA/PIC进行胚性愈伤组织诱导，将胚性愈伤组织在MS加6-BA加NAA进行增殖培养得到体细胞胚的再生方式；CN108464242A公开了以百合无菌苗的外层鳞片接种于MS加PIC加ABA的培养基中进行原胚诱导，在MS加PIC加NAA进行体胚增殖培养，并对体胚进行萌发和成苗培养的方法，该方法体胚诱导时间短、体胚质量佳。

2.3 组织培养在种质资源和育种中的应用

2.3.1 组织培养与脱毒

百合作为球根花卉，常采用鳞茎、鳞片等进行繁殖，容易发生病毒感染，病毒病严重影响了百合的生产，常见的病毒病有黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒。通过组织培养可得到脱毒植株，将组织培养与茎尖培养、热处理以及化学试剂结合进行脱毒。如，CN11280059A公开了以中内层健康的鳞片为外植体培养得到无菌苗，切取无菌苗小鳞片进行愈伤组织诱导，随后分化诱导得到无毒的成苗，该方法能快速高效得到脱毒苗；CN110268980A公开了以健康鳞茎为外植体得到无菌苗，再将无菌苗进行热处理，以热处理的茎尖为外植体进行脱毒培养得到脱毒苗。

2.3.2 组织培养与离体保存

离体培养的植株、器官或细胞通过限制、延缓或停止其生长的方法保存，占据空间小，便于交流利用，避免种质丢失。高渗透压保存是百合种质资源保存中常见的1种方式。如，CN101796925A公开了将诱导再生的鳞茎芽切去芽顶部和部分基部组织后，接种在1/2MS加NAA加PP333加甘露醇加AC的离体保存与试管鳞茎膨大同步培养基中，使得离体保存的效率提高50%～60%。通过降低温度减弱培养物的生命活动从而达到抑制生长、保存种质的目的也是百合种质保存中常见的方式。如，CN110367125A公开了在百合鳞茎培养期间进行间隔性的低温刺激，随后恢复常温培养小鳞茎，再将百合鳞茎在常温、低温、超低温条件下保存，通过对百合鳞茎提前进行驯化，避免其在超低温条件保存时出现冻伤，导致活性丧失；CN104255711A公开了采用玻璃化超低温保存方法对百合胚性愈伤组织进行保存，通过向冷冻保护剂中添加纳米材料有效提高保护剂的粘度和热导率，使得保存后的恢复生长率显著提高。

2.3.3 组织培养与多倍体诱变

远缘杂交是百合育种的重要手段，然而远缘杂种间由于染色体不能正常分离表现出不育，限制了远缘杂交在百合育种中的应用，通过秋水仙素、氟乐灵对花药培养得到的单倍体加倍或者体细胞染色体加倍可有效解决这一问题。如，CN106106152A公开了在诱导前采用秋水仙素对材料进行预培养，继而对不定芽进行继代培养分离嵌合体，之后进行丛生芽生长和生根培养得到纯合四倍体材料，该方法诱导率高，四倍体植株生长正常、倍性稳定，可作为新品种培育的重要种质材料。另外，百合三倍体具有特异的品种和营养生长优势，常规的方法是将四倍体和二倍体杂交，但是该方法周期短，采用组织培养结合诱变能快速得到三倍体百合。如，CN1579144A公开了采用秋水仙素点滴法处理花芽，按照常规栽培技术继续培养上述植株，将三倍体胚接种在MS加6-BA加GA3培养基上进行离体培养、染色体鉴定，将最终确定的三倍体植株的鳞片接种在MS加6-BA加NAA继代培养，选育出三倍体百合新类型。

2.3.4 组织培养与遗传转化

百合同时具有观赏、食用、药用价值，其种质资源遗传变异丰富，培育花型优美、花色丰富，抗盐、碱、旱、病虫害等抗逆性强的百合品种是当前市场的需求，然而传统的杂交育种存在周期长的问题。通过农杆菌介导的遗传转化是改良植物的有效手段。如，CN1561697A公开了1种百合遗传转化体系建立的方法，其以百合鳞茎或花丝为外植体建立高频的再生系统，通过抗生素敏感试验确定了筛选浓度，建立了高效的转化体系；CN101302519A公开了以麝香百合的鳞茎为外植体得到无菌苗，从半夏中克隆pta基因构建载体，通过农杆菌介导的pta基因转化百合叶片得到抗性再生植株，最终获得抗蚜虫型提高的转基因百合；CN101302518A公开了从百合中克隆Liaco基因的反义片段，构建表达载体，用农杆菌介导将antiLlaco转入百合得到转基因植株，通过衰老试验测定转化植株的耐衰老性，得到寿命延长的转基因百合植株。

3 结语

百合具有较高的商品价值，通过组织培养可快速得到再生百合幼苗，目前对百合高效再生体系的研究较多，如何进一步优化再生方法得到繁殖系数高、周期短、成本低的再生体系，以及进一步将组织培养与杂交育种、诱变育种、种质资源保存、脱毒、遗传转化相结合是百合组培工厂化生产中的研究方向。