芥子气中毒人员尿液标记物谱分析及其临床诊断应用

张雅姣，徐 斌，徐 华，吴剑锋，陈 佳，王春燕，郭 磊，邱泽武，谢剑炜*

(1.军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850；2.解放军总医院第五医学中心，北京 100039)

芥子气(Sulfur mustard，简称SM；美军代号HD)化学名为2,2′-二氯乙基硫醚，是一种剧毒糜烂性化学毒剂，可通过呼吸道、皮肤、粘膜与眼睛等部位进入机体，毒性表现为皮肤黏膜起疱、呼吸道感染、免疫系统受损、生殖系统功能缺失等[1]，甚至导致癌症以及长期病症[2]。历史上芥子气曾在一战与两伊战争等多次战争中使用，导致近百万人员伤亡，同时也是二战时日本在华遗弃化学武器的最主要组成，已在我国造成多起人员中毒事件，如齐齐哈尔“8.4”芥子气中毒事件等[3]，至今仍严重威胁着我国人民生命与生态环境的安全。另外，在当今日益复杂的国际环境下，芥子气具有被用于战争冲突和恐怖袭击的潜在可能，如2015年叙利亚恐袭事件，芥子气施放造成大量人员伤亡[4-5]。

芥子气合成问世已近200年，但其全部毒理机制仍未阐明，临床无特效救治药物，仅按照烧伤对症治疗[6]；且中毒后潜伏期较长，临床早期诊断存在较大困难，亟需从芥子气体内代谢特征研究的角度进行溯源分析。芥子气是一种高反应活性的烷基化物质，生理条件下快速形成硫鎓离子，可与体内亲核物质/亲核位点发生广泛的化学作用。体内代谢途径主要分为4类：①水解/氧化过程产生硫二甘醇(TDG)、硫二甘醇亚砜(TDGO)、芥子亚砜(SMO)、芥子砜(SMO2)、二乙烯砜(DVS)等；②与谷胱甘肽(GSH)加合后，经氧化与β裂解酶或乙酰转移酶作用产生1,1′-磺酰基-二[2-S-(N-乙酰半胱氨酸)]乙烷(SBSNAE)、1,1′-磺酰基-二(2-甲硫基)乙烷(SBMTE)、1-甲基亚磺酰基-2-(2-甲硫基乙基磺酰基)乙烷(MSMTESE)、1,1′-磺酰基-二(2-甲基磺酰基)乙烷(SBMSE)等；③与DNA分子碱基加合形成系列单加合物与双链交联加合物，主要包括N7-(2-羟乙基硫代乙基)鸟嘌呤(N7-HETEG)、O6-(2-羟乙基硫代乙基)鸟嘌呤(O6-HETEG)、N3-(2-羟乙基硫代乙基)腺嘌呤(N3-HETEA)与双[2-(N7-鸟嘌呤)]乙硫醚(Bis-G)；④与蛋白质加合产生血红蛋白缬氨酸加合物(HETE-Val)、组氨酸加合物(HETE-His)、白蛋白酪氨酸加合物等(图1)。

图1 芥子气的代谢途径及主要产物示意图Fig.1 The metabolic way and major metabolites of sulfur mustard*metabolites underlined were analyzed in this work;collected from references[7-16]

上述4类十余种代谢产物或加合物被认为是芥子气暴露的重要生物标记物，已从动物水平获得了系列数据，亦受到芥子气暴露溯源、毒性评价与机制研究方面的高度重视[7-16]，近年来逐步用于国内外数例芥子气人员中毒事件的溯源性研究。目前主要为血、尿样本，亦有少数组织样本，多利用气相色谱-质谱(GC-MS)与液相色谱-质谱(LC-MS)技术对一类或几类标记物进行分析。如针对4例两伊战争中伊朗芥子气中毒伤员，在其暴露后5～10 d的血液中检出HETE-His与HETE-Val蛋白加合物[17]；对于2例意外接触芥子气伤员，在暴露后2～3 d的尿液中检出水解产物TDG、TDGO，以及GSH-β裂解产物SBMSE、MSMTESE等[18]；对于9例芥子气中毒人员，血液中检出血红蛋白加合物与白蛋白加合物[19-20]等。

2014年，本课题组针对我国4例芥子气意外中毒伤员，对其组织渗出液、血液及尿液中4类12种代谢产物进行定量分析，开展近4个月的暴露溯源追踪，并发表国际首例芥子气临床全标记物谱的研究报道，为临床诊治与预后评估提供了精准指标[21]。系列研究显示芥子气在人与实验动物体内的代谢机制具有相似性：中毒早期，水解/氧化产物以及GSH-β裂解产物的相对含量较高，但中毒检测窗较短，7 d后约90%产物随尿液排出体外；而DNA与蛋白加合物的检测窗可长达30～103 d，更适用于中毒后的长期溯源确证。

本文以1例疑似日遗化武芥子气中毒人员暴露后的尿液样本为研究对象，建立了尿液中7种游离代谢产物(TDG、TDGO、SMO、SBMTE、MSMTESE、SBMSE和SBSNAE)的两步固相萃取联用超高效液相色谱-串联质谱(SPE/UPLC-MS/MS)同时定量分析方法；结合课题组前期建立的尿液中游离碱基加合物的同位素稀释-UPLC-MS/MS法[14]，从无损样本的角度，对患者尿液中可能赋存的芥子气生物标记物进行溯源分析。研究结果为临床诊断、疗效评价以及预后评估等提供了直接评价指标。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：ACQUITY超高效液相色谱系统(美国沃特世公司)，5500 Qtrap串联质谱仪(美国爱博才思公司)，Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司)；正压式固相萃取仪(北京普立泰科公司);阳离子交换(MCX)固相萃取柱(200 mg/3 mL)、HLB固相萃取柱(200 mg/3 mL)(美国沃特世公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯)购自韩国德山公司，TDG、甲酸(色谱纯)、甲酸铵(质谱级)购自美国西格玛-奥德里奇公司，D8-TDG(纯度>95%)购于美国剑桥CIL公司，乙酸铵(分析纯)购于中国国药集团有限公司，N7-HETEG(纯度>96%)、O6-HETEG(纯度>98%)、Bis-G(纯度>97%)、N3-HETEA(纯度>98%)、TDGO、SMO、SBMTE、SBMSE、MSMTESE、SBSNAE、SBESE(纯度均大于95%)为本课题组微量合成制备[10]；内标D4-N7-HETEG、D4-O6-HETEG、D4-Bis-G、D4-N3-HETEA(氘代率均大于99%)为本课题组微量合成制备[16]。超纯水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q A10纯水系统(美国密理博公司)制备。

1.2 病例样本

中毒患者为22岁男性，在某次日遗化武销毁现场作业7 h后，右肩皮肤出现烧灼感、伴有发红现象，9 h后烧灼感与红斑愈加明显，约11 h后送至某医院中毒救治科进行治疗。经诊断该患者右肩可见5 cm×5 cm红斑、多个水疱并伴随破溃现象，烧伤等级为Ⅱ°，面积1%；总胆红素与胱抑素C指标升高，提示肝功能与氧化应激水平异常；后续治疗以抗感染、保肝、补液促排、局部换药等对症方案为主，7 d后出院。患者口述其在操作中不慎将1滴液体溅至右肩部位，疑似芥子气皮肤暴露中毒。

采集患者暴露后3～7 d的全部尿液，于-70 ℃冷冻保存。检测时将样本于室温条件下融解，对其中生物标志物进行定量检测，并利用尿液中肌酐含量对结果进行校正，绘制时效曲线(n=3)。

1.3 尿液中芥子气水解氧化产物与谷胱甘肽加合物的β裂解产物检测

1.3.1 固相萃取采用MCX-HLB两步固相萃取法。用2 mL甲醇和2 mL水活化MCX柱，取500 μL尿样与100 μL混合内标上样，收集流穿液，以2 mL甲醇洗脱，将流穿液与洗脱液合并后浓缩至干，以0.5 mL乙酸铵水溶液(1 mol/L)复溶，待HLB处理。用2 mL甲醇和2 mL乙酸铵水溶液(1 mol/L)活化HLB柱，取0.5 mL复溶样品上样，0.5 mL乙酸铵水溶液(1 mol/L)淋洗，1 mL甲醇洗脱，洗脱液浓缩至干，以100 μL甲醇水溶液(5%)复溶，待仪器检测。

1.3.2 仪器条件液相色谱条件：Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：A相为含10 mmol/L 甲酸铵和0.1%甲酸的水溶液，B相为甲醇；流速为0.25 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。梯度洗脱条件：0～2 min，2%B；2～7 min，2%～95%B；7～7.1 min，95%～2%B；7.1～12 min，2%B。

质谱条件：卷帘气为20 psi(约为1.38×105Pa)，碰撞气为9 psi(约为0.62×105Pa)，电喷雾电压为1 500 V，源温为550 ℃，离子源气体1和2均为55 psi(约为3.79×105Pa)，解簇电压为50 V，入口电压为10 V，碰撞室入口电压为16 V；定量离子对与对应碰撞电压如图3所示。

1.3.3 方法学考察取人空白尿液作为基质(n=12)，采用逐级稀释法配制质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100、200 ng/mL(SMO与MSMTESE为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL)的7个代谢物混合标准工作溶液，测定其检出限(S/N>5)、定量下限(S/N>10)与线性范围，并绘制线性曲线。设置定量下限、低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)和高浓度质控样品(HQC)，按照“1.3.1”和“1.3.2”考察方法的准确度、精密度、回收率与基质效应。按照结构特点将目标物分为两类并分别设置内标：TDG、TDGO、SMO的内标为D8-TDG，SBMTE、MSMTESE、SBMSE、SBSNAE的内标为SBESE。

2 结果与讨论

2.1 尿液中芥子气游离代谢产物的SPE净化富集

目前，对于芥子气游离代谢产物(水解氧化产物与GSH加合后经β裂解酶或乙酰转移酶作用的水解产物)多采用HLB固相萃取柱进行净化与富集[22]。然而尿液成分复杂，较高极性化合物极易受基质干扰、影响质谱响应，因此本研究对固相萃取方式进行优化，增加阳离子交换(MCX)净化步骤，从而有效去除尿液基质中无机盐阳离子与碱性化合物等干扰。

考察了MCX固相萃取各步骤中7种代谢物的回收率。由于代谢物结构与性质各异，在固相萃取柱上存在不同的保留行为，如SMO、SBMTE、MSMTESE与MCX填料结合力较弱，不易保留，较易洗脱(图2A)。为全部获取不同极性代谢物，在MCX-SPE环节设置了合并收集上样流穿液与洗脱液的步骤。随后考察了MCX-HLB SPE的净化效果(图2B)，对于TDG等高极性代谢物，增加MCX净化步骤后，质谱响应可提高64倍。因此，建立的两步固相萃取法可有效降低尿液基质干扰，显著提高分析物的质谱响应，同时实现分析物的高效净化富集。

2.2 方法学考察

依据美国食品药品监督管理局(FDA)[23]、2020年版《中国药典》[24]中生物样品定量分析方法验证指导原则，按照“1.3.3”进行方法学考察，所有指标均满足生物样本分析的方法学要求。

芥子气7个游离代谢产物的UPLC-MS/MS色谱图见图3。7种代谢物的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为5 pg/mL～1 ng/mL与10 pg/mL～5 ng/mL；分别以7种代谢物的质量浓度(ng/mL)为x轴，以代谢物与内标的峰面积比值为y轴，拟合线性曲线，得到线性范围为LOQ～200 ng/mL(SMO、MSMTESE为LOQ～20 ng/mL)；相关系数(r2)为0.992 1～0.999 1(表1)。

图3 芥子气7个游离代谢产物的UPLC-MS/MS(MRM)色谱图Fig.3 UPLC-MS/MS spectra of seven free metabolites in vivo after SM exposure in MRM modeTDG：100 ng/mL；TDGO,SBMTE,SBMSE and SBSNAE：20 ng/mL；SMO and MSMTESE：2 ng/mL；D8-TDG：300 ng/mL；SBESE：50 ng/mL

表1 方法的检出限、定量下限与线性关系(n=3)Table 1 LODs,LOQs and linearity of the method(n=3)

按照LOQ、LQC、MQC与HQC的质控浓度考察方法批内(n=3)、批间(d=3，n=3)的准确度与精密度(分别以回收率和相对标准偏差表示)。7种代谢物的回收率为86.2%～106%，相对标准偏差(RSD)为3.0%～18%(表2)。

7种代谢物的性质不同，回收率与基质效应均存在差异。其中TDG的回收率最低，约为72.0%～79.8%；其它代谢物的回收率为80.1%～117%。经过两步固相萃取净化后，7种代谢物的基质效应为85.3%～117%，基质干扰显著降低(表2)。

表2 方法的准确度、精密度、回收率与基质效应(n=3)Table 2 Accuracy,inter-day,intra-day precisions,recoveries and matrix effects of the method(n=3)

2.3 案例应用

2.3.1 水解产物的含量测定目前普遍认为，芥子气水解产物TDG与TDGO在生物体内均存在一定本底值，分别为0～1 ng/mL(TDG本底值低于本方法检出限)、2～8 ng/mL[25-26]，仅在其含量显著高于本底值(具有统计学差异)时，方可指证芥子气暴露。SMO是芥子气的氧化产物，在血液与肝脏组织中含量较高，尿液中含量较低，以往尚无SMO作为芥子气暴露的尿液生物标记物的报道；但SMO具有芥子气特征结构、不存在体内本底，同时检测方法简便、灵敏。表明较之TDG与TDGO，尿液中的SMO是一种良好的芥子气暴露生物标记物。

表3结果显示，中毒患者尿液中检出3种水解氧化产物。其中TDG仅在暴露后3、4、7 d检出，结果低于方法定量下限，无法准确定量；TDGO的含量显著高于本底值，在暴露后4 d达到峰值，随后迅速降低，第7 d仍可检出；SMO的含量较低(<0.1 ng/mL尿液)，其含量变化趋势与TDGO类似(图4A)。值得注意的是，TDG与TDGO在暴露第5 d含量显著降低，而SMO的含量仍较高，提示TDGO可能由SM水解为TDG后再氧化产生，而不是先氧化为SMO再水解产生。

表3 中毒患者住院5 d内尿液中3类11种生物标记物的质量浓度(ng/mL)Table 3 Concentrations of hydrolysis/oxidation products and β-lyase metabolites of sulfur mustard in urine samples of exposed patient in 5 days(ng/mL)

2.3.2 谷胱甘肽加合物-β裂解产物的含量测定与SMO类似，谷胱甘肽加合物-β裂解产物具有芥子气特征结构，常用作芥子气暴露生物标记物，主要样品为血浆与尿液，检测方法包括利用LC-MS法[22]，或将所有产物还原为SBMTE后利用GC-MS分析[11]。

表3结果显示 ，该中毒患者尿液中7 d内均可检出SBMSE、MSMTESE、SBSNAE，未检出SBMTE。SBMSE的含量最高，暴露后4 d达到峰值；SBSNAE的含量稍低，暴露后5 d达到峰值；MSMTESE的含量与SBSNAE相当，但其在暴露后5 d含量低于定量下限，无法准确定量(图4A)。

2.3.3 尿液中7种游离代谢产物的含量关系分析根据课题组前期工作，芥子气暴露后尿液中上述7种游离代谢产物约在第3 d达到峰值，7 d内>90%的代谢物会经尿液排出体外[21]。本研究采集患者中毒后3～7 d的尿液，可较好反映体内的完整代谢过程。

根据采集尿液的总体积与检测浓度，计算各代谢物在3～7 d内的累积排出量及其含量的相对比例关系。SBMSE的累积排出量最高，占60.2%；TDGO的含量稍低，占23.4%；SBSNAE与MSMTESE分别占3.7%与1.5%；SMO的含量最低，仅占0.4%(图4B，表4)。

2.3.4 尿液中芥子气暴露后游离碱基加合物的含量分析DNA烷基化损伤是芥子气的毒性始发机制与物质基础，因此其DNA加合物可作为芥子气内暴露的效应标记物，指示机体中毒情况；其中绝大部分加合物可经DNA修复机制作用被切除，并以碱基加合物形式随尿液排出。本课题组前期已建立尿液中同时检测4种游离碱基加合物的同位素稀释-UPLC-MS/MS法，检出限可达0.002～0.01 ng/mL[14]。利用该方法对中毒患者尿液样本进行分析，可定量评价其中毒损伤程度。

表3和图4C结果显示，中毒患者尿液中4种SM-DNA加合物均可检出，暴露后3 d含量最高，随后总体呈降低趋势。4种SM-DNA加合物的含量关系为N7-HETEG>Bis-G>N3-HETEA>O6-HETEG，N7-HETEG的含量约占总加合物量的63.5%，Bis-G约占31.8%，N3-HETEA约占4.3%，而O6-HETEG的含量最低，仅约占0.5%(图4D，表4)。

表4 中毒患者住院5 d内尿液中3类生物标记物的累积量及其比例关系Table 4 Cumulant of three kinds of biomarkers in urine of exposed patient in 5 days and their proportional relationship

图4 中毒患者住院后尿液中3类生物标记物含量随时间的变化趋势(经肌酐校正后结果)Fig.4 Time-dependent profiles of three kinds of biomarkers in urine samples from exposed patient(results after creatinine correction)A:metabolites(hydrolysis/oxidation products TDGO,SMO and GSH-β-lyase metabolites SBMSE,MSMTESE and SBSNAE);B:cumulative content of free metabolites in 5 days;C:four sulfur mustard-DNA adducts;D:cumulative content of four SM-base adducts in 5 days

4种SM-DNA加合物中，O6-HETEG可直接破坏配对碱基间的氢键，常视作芥子气的效应标记物；然而O6-HETEG的含量较低，常在定量下限附近，易导致结果偏差。同时，Bis-G作为一种双交联加合物，可直接使DNA分子产生链内或链间交联，影响DNA正常复制导致损伤[12]；且Bis-G含量较高，更适宜作为指示毒剂内暴露情况的效应标记物。

3 结 论

本研究首先建立了芥子气中毒患者尿液中7种游离代谢产物的UPLC-MS/MS同时定量新方法，检出限为5 pg/mL～1 ng/mL，方法学考察指标均满足生物样本分析的要求；基于不同功能的填料构建两步固相萃取法，显著降低了尿液基质干扰并实现较高回收率；结合前期建立的4种游离碱基加合物的同位素稀释UPLC-MS/MS定量方法，应用于1名疑似芥子气中毒人员尿液样本中不同类型、不同功能生物标记物谱的筛查分析，确证其暴露毒剂种类。

针对中毒患者尿液实现了3类10种芥子气生物标记物的检出，包括本研究首次检测的SMO，可确切指证患者为芥子气中毒。根据时效关系曲线，标记物在3～4 d达到峰值(TDG除外)，7 d仍可检出；GSH-β裂解产物的含量相对较高(最高值为11.2 ng/mL)，水解氧化产物其次(最高值为3.70 ng/mL)，SM-DNA加合物最低(最高值为0.312 ng/mL)；因此GSH-β裂解产物是一类较好的芥子气暴露生物标记物。基于课题组前期工作[14]，人体尿液中 DNA加合物可检测至暴露后30 d，也是芥子气暴露后临床诊断重要的长期生物标记物。以上游离代谢产物与DNA碱基加合物构成了尿液中可能赋存的芥子气主要生物标记物谱，可为临床早期诊断与预后评估提供合理的检测指标。